人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)腦出血后細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、背景:
　　腦出血是一種高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的腦血管疾病。在亞洲國家，腦出血占所有卒中的20-30％，其中有30-40％在急性期死亡。腦出血后引起血腫周圍腦組織損傷，主要由于血腫的占位效應(yīng)和直接損傷，其他包括血腫周圍組織缺血、繼發(fā)炎癥反應(yīng)、紅細(xì)胞溶解產(chǎn)生的血紅蛋白所誘導(dǎo)的毒性反應(yīng)直接破壞周圍腦組織，神經(jīng)元凋亡及等因素引起腦組織水腫、移位和損傷，其中P53,Bcl-2和Bax基因在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，從而出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功

2、能缺損癥狀和體征。因此，研究腦出血的治療非常重要。近年來，腦出血微創(chuàng)清除術(shù)受到關(guān)注，微創(chuàng)治療可以在腦出血早期減輕血腫對(duì)周圍腦組織的壓迫，解除占位效應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)，避免直接的化學(xué)刺激，從而緩解腦組織繼發(fā)損傷。但神經(jīng)元是不可再生細(xì)胞，單純血腫抽吸治療腦出血，并不能從根本上促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞(HUC-MSCs)具有多項(xiàng)分化潛能，HUC-MSCs用于腦卒中的治療實(shí)驗(yàn)研究表明，神經(jīng)生長因子的分泌，減輕炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡等

3、機(jī)制促進(jìn)了神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)采用微創(chuàng)血腫清除術(shù)、微創(chuàng)血腫清除術(shù)聯(lián)合臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠出血性腦卒中，探討HUC-MSCs細(xì)胞移植對(duì)細(xì)胞凋亡和對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)的影響，探索治療方案可行性，為急性期臨床治療出血性腦卒中提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法共納入120只SD大鼠，隨機(jī)分為4組:(1)對(duì)照組（Control組）:用骨鉆在顱骨鉆孔，于定位穿刺點(diǎn)用微量進(jìn)樣器穿刺右側(cè)尾狀核區(qū);(2)腦出血組（ICH組）:

4、麻醉后固定于腦立體定位儀，骨鉆定位鉆孔，于穿刺點(diǎn)用微量進(jìn)樣器注射Ⅳ型膠原酶入右側(cè)尾狀核區(qū);(3)微創(chuàng)血腫清除組（MIS組）腦出血大鼠模型造模成功6小時(shí)后，用自制血腫清除裝置行微創(chuàng)血腫清除術(shù);(4)細(xì)胞移植治療組(MSC組)腦出血大鼠模型行微創(chuàng)血腫清除術(shù)后同部位注入HUC-MSCs懸液。每組大鼠分別于ICH建模后1d、2d、5d、9d、14 d和21d處死，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠。臍帶取自足月剖宮產(chǎn)健康產(chǎn)婦，分離、培養(yǎng)、分化干細(xì)胞，BrdU標(biāo)

5、記HUC-MSCs。腦出血模型制備成功后6h行微創(chuàng)血腫清除術(shù)和HUC-MSCs移植。肝素化生理鹽水注入右心耳，大鼠僵化后斷頭取腦，固定腦組織。腦組織切片以備免疫組織化學(xué)染色。檢測(cè)細(xì)胞CD29，CD34，CD44, CD90和CD105的表達(dá)，鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞。檢測(cè)P53，Bcl-2和Bax在腦組織的表達(dá)，反映細(xì)胞凋亡情況。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。檢測(cè)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)方式表示，P＜0.05時(shí)被認(rèn)為組間

6、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)分離培養(yǎng)的HUC-MSCs干細(xì)胞，在顯微鏡下呈長纖維狀排列。HUC-MSCs細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色，通過觀察，CD44、CD29、CD90、CD105陽性表達(dá)，而CD34陰性表達(dá)，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特點(diǎn)，鑒定為HUC-MSCs干細(xì)胞。共計(jì)120只腦出血模型大鼠Bederson評(píng)分大于2分，建模成功。大鼠移植血腫部位接受BrdU標(biāo)記的HUC-MSCs細(xì)胞移植

7、后，采用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在1d到21d均可見到BrdU染色陽性的細(xì)胞，并且在血腫周圍組織、顳葉海馬區(qū)及大腦皮質(zhì)區(qū)有染色陽性細(xì)胞，而Control組、ICH組和MIS組腦組織內(nèi)免疫組化未顯示陽性細(xì)胞，表明在細(xì)胞移植后，HUC-MSCs細(xì)胞能夠成活并遷徙到血腫附近及遠(yuǎn)隔組織。ICH組、MIS組和MSC組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分均顯著低于control組(P＜0.05);從2d開始，MIS組和MSC組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)mNSS評(píng)分均

8、顯著低于ICH組(P＜0.05); MSC組較MIS組在5d、9d、14d和21d評(píng)分低(P＜0.05)。腦組織免疫組化結(jié)果顯示，腦出血后3個(gè)干預(yù)組與對(duì)照組相比，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)P53表達(dá)陽性數(shù)均有明顯差別(P＜0.05); MSC組在1d、2d時(shí)與MIS組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，MSC組在5d、9d、14d和21d時(shí)P53陽性表達(dá)低于MIS組(P＜0.05)，在2d、5d、9d、14d和21 d時(shí)，MIS組P53陽性表達(dá)低于ICH組(P＜0.0

9、5)。與對(duì)照組相比，從術(shù)后5d開始，ICH組、MIS組和MSC組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)Bcl-2表達(dá)陽性率均有明顯增強(qiáng)(P＜0.05); MSC組在9d、14d和21d時(shí)Bcl-2陽性表達(dá)明顯高于MIS組(P＜0.05); MIS組Bcl-2陽性表達(dá)在5d、9d、14d和21d時(shí)高于ICH組。MSC組在5d、9d、14d和21d時(shí)陽性表達(dá)低于MIS組(P＜0.05)，在2d、5d、9d、14d和21d時(shí)，MIS組Bax陽性表達(dá)低于ICH組(P＜0

10、.05)。腦出血后P53和Bax的表達(dá)在1d達(dá)高峰，第5d表達(dá)逐漸減少。Bcl-2的表達(dá)在2d時(shí)達(dá)高峰，第5d維持在高表達(dá)狀態(tài)，隨后表達(dá)逐漸減少。
　　結(jié)論:
　　腦出血導(dǎo)致血腫周圍腦組織凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。細(xì)胞移植后，HUC-MSCs細(xì)胞可以在血腫周圍存活并遷移到遠(yuǎn)隔組織。P53、Bax、Bcl-2表達(dá)主要集中于血腫周圍組織、皮質(zhì)、皮質(zhì)下和海馬區(qū)的胞漿內(nèi)。微創(chuàng)血腫清除和微創(chuàng)術(shù)后HUC-MSCs細(xì)胞移植都增加血腫周圍腦組織B