人臍帶間充質(zhì)干細胞誘導為脂肪細胞的研究.pdf

1、研究目的:間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一類較原始的干細胞，具有高度增殖性和多向分化潛能。目前研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細胞，而臍帶間充質(zhì)干細胞近幾年才被人們重視并加以研究。與骨髓間充質(zhì)干細胞相比，臍帶間充質(zhì)干細胞不僅具有相似的增殖特性及多向分化潛能，而且具有取材方便、來源廣泛、免疫原性更低等優(yōu)勢，這是其成為近年來干細胞研究領(lǐng)域中的熱點。本研究建立了分離純化人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbili

2、cal cordmesenchymal stem cell，hUC-MSC)的方法，并對其表面標志進行了鑒定。同時研究間充質(zhì)干細胞向脂肪細胞的誘導分化，并探討其分化過程中miRNA-27a和miRNA-143的表達，為闡述間充質(zhì)干細胞脂向分化的調(diào)控機制提供了新的思路，并有一定的臨床應(yīng)用價值。
　　研究方法:在嚴格無菌條件下，采集健康足月胎兒的臍帶組織，采用酶消化法和組織塊貼壁法進行原代細胞分離培養(yǎng)，通過流式細胞儀對其表面標記進行檢

3、測。將原代細胞進行傳代培養(yǎng)，并將第5代間充質(zhì)干細胞經(jīng)IBMX、胰島素、吲哚美辛和地塞米松聯(lián)合使用進行脂向誘導。利用油紅O免疫組化染色的方法鑒定分化后的細胞，使用實時熒光定量PCR技術(shù)比較間充質(zhì)干細胞和脂肪細胞中miRNA-27a和miRNA-143以及它們靶基因的表達。隨后分析miRNA-27a和miRNA-143以及它們對應(yīng)靶基因的變化趨勢。
　　研究結(jié)果:分離純化后的hUC-MSCs呈均勻有序的成纖維細胞形態(tài)。臍帶酶消化法培養(yǎng)

4、的細胞2-3天可見成纖維樣細胞，3-5天后在倒置顯微鏡下可見散在分布的細胞集落，貼壁后的細胞增殖速度較快，原代細胞培養(yǎng)5天后可見大量細胞，融合度達80％。使用組織塊培養(yǎng)法，5-7天可見臍帶組織塊周圍有細胞爬出，爬出的細胞隨后貼壁生長，呈短粗梭型或多角形。貼壁后的細胞增殖速度快，2周左右細胞可達80-90％融合。兩種方法下，當細胞達到80-90％的融合度時，按1∶3的比例進行傳代，傳代后細胞生長3-6小時便可貼壁，最初為短粗的梭形或者卵圓

5、形，24小時后細胞變?yōu)殚L梭形或多邊形，細胞均勻分布，平行排列生長或旋渦狀生長，約3天可達到80％融合。取第5代臍帶間充質(zhì)干細胞進行流式細胞術(shù)檢測細胞表面標記物，結(jié)果顯示hUC-MSCs高表達CD44、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC，不表達CD34、CD106，符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性。在將其定向誘導為脂肪細胞的過程中，利用吲哚美辛、地塞米松、胰島素以及3-異丁基-1-甲基黃嘌呤四種誘導劑可以使臍帶間充質(zhì)干細胞分化為

6、脂肪細胞的效率達到90％以上，且絕大多數(shù)為油紅O染色陽性的成熟脂肪細胞。利用實時熒光定量PCR檢測證實miRNA-27a在MSCs脂向分化的過程中顯著下調(diào)(0.0095±0.002vs1±0.03); miRNA-143的相對表達量則顯著上調(diào)(17.81±0.88vs1±0.004)。
　　結(jié)論:該研究證實采用酶消化法和組織塊法均能分離得到人臍帶間充質(zhì)干細胞，且均具有高度的增殖能力，流式細胞儀檢測符合間充質(zhì)干細胞的生物學特性。在體