人脂肪間充質干細胞誘導分化內耳毛細胞樣細胞的實驗研究.pdf

1、內耳毛細胞對于維持聽覺及平衡功能至關重要。但內耳細胞結構易受外傷、藥物毒性、感染、遺傳缺陷、年齡老化等多種因素的破壞，使毛細胞損傷，導致聽覺及前庭功能障礙。目前人工耳蝸植入是這種重度感音神經(jīng)性聾唯一可靠治療方法，而相關研究表明通過干細胞替代耳蝸毛細胞也具有治療感音神經(jīng)性聾的可能性。前期研究指出，干細胞是一類具有未分化、全能或多能、并且具有能自我更新能力的細胞，其在適當?shù)陌麅然蛘{控，胞間聯(lián)系及環(huán)境因素下具有分化為體內任何一種類型細胞的能

2、力。脂肪來源的間充質干細胞(AD—MSCs)在體外經(jīng)誘導，能分化出類似神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，且具有類神經(jīng)細胞的功能。本研究探討通過利用人脂肪源性間充質干細胞(human adipose—derived mesenchymal stem cells，hAD—MSCs)體外定向誘導向耳蝸毛細胞方向分化，為干細胞耳蝸內移植治療感音神經(jīng)性聾提供新的細胞來源；并將人脂肪源性間充質干細胞移植入致聾小鼠耳蝸內，觀察移植細胞的體內存活及移行轉化情況。

3、 目的: 1、在體外驗證將人脂肪源性間充質干細胞(human adipose—derived mesenchymal stem cells，hAD—MSCs)定向分化為耳蝸毛細胞的可行性。 2、建立小鼠藥物性耳聾模型；探討耳蝸細胞移植途徑；驗證人脂肪來源的間充質干細胞移植入藥物致聾后的小鼠耳蝸內的存活，定植及分化結果。 方法: 1、分離并培養(yǎng)擴增人脂肪來源的MSCs，流式細胞儀進行細胞表型分析，及細

4、胞周期分析。 2、用特定的培養(yǎng)體系配合多種細胞因子定向誘導hAD—MSCs向神經(jīng)祖細胞樣細胞分化，培養(yǎng)后細胞進行免疫組化鑒定。 3、將誘導后細胞與發(fā)育期雞胚聽泡細胞在體外進行共培養(yǎng)，以促使其向內耳毛細胞分化，通過免疫組化等方法對分化不同階段的細胞特異性指標進行鑒定。 4、聯(lián)合應用硫酸卡那霉素及呋塞米快速制備藥物性聾小鼠動物模型 5、經(jīng)外半規(guī)管途徑及靜脈途徑向藥物性耳聾小鼠耳蝸內移植入hAD—MSCs，通過

5、組織免疫熒光及逆轉錄—聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測植入細胞的轉化情況。 結果: 1、體外hAD—MSCs誘導后呈現(xiàn)神經(jīng)干祖細胞樣的形態(tài)并表達其特異性標志Nestin， 2、體外hAD—MSCs經(jīng)誘導再與發(fā)育期雞胚聽泡細胞共培養(yǎng)后表達內耳毛細胞特異性標志Mathl和MyosinⅦa。 3、人脂肪來源的間充質干細胞移植入藥物致聾后的小鼠耳蝸內，觀察到移植細胞能夠在耳蝸內至少存活2周，耳蝸Rosentha

6、l's管及耳蝸感覺上皮可見少量植入細胞，耳蝸Corti器區(qū)植入細胞表達耳蝸毛細胞特異性抗體MyosinⅦa。小鼠耳蝸提取總cDNA，進行RT-PCR檢測可見耳蝸有人特異性看家基因beta—actin及少量Math—1表達。 結論: 1、hAD—MSCs在體外可定向誘導分化為具有內耳毛細胞特異性標志的內耳毛細胞樣細胞。 2、hAD—MSCs移植入藥物性聾小鼠耳蝸內能夠存活，移行定植于Rosenthal's管及耳蝸感