體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究姓名：楊永明申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：耳鼻咽喉科學(xué)指導(dǎo)教師：江紅群20100601摘要Corti氏器。再加入2ml025％胰蛋白酶(含EDTAlmmol／L)置入37℃孵箱8min進(jìn)行消化，中止消化并離心后棄去上清液，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。3分化細(xì)胞的基因表達(dá)分析：分兩組：空白對(duì)照組及共培養(yǎng)組?？瞻讓?duì)照組是指取第四代MSCs，按(5104cells／m1)密度接

2、種于6孔板，不與耳蝸Corti氏器細(xì)胞共培養(yǎng)，滴加有EGF／bFGF／IGF—l以及N2和B27的DMEM／F12(1：1)無(wú)血清培養(yǎng)液，隔日換液一次，連續(xù)14天，再收集培養(yǎng)細(xì)胞。共培養(yǎng)組是指取第四代MSCs，按上述培養(yǎng)條件，與耳蝸Corti氏器細(xì)胞共培養(yǎng)14天，再收集分化細(xì)胞，將收集的兩組細(xì)胞分別提取總RNA，用于RTPCR鑒定。4分化細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：用毛細(xì)胞的標(biāo)志物(Myosin7A、Mathl、Calretinin)對(duì)分化

3、細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。結(jié)果：1培養(yǎng)第四代的MSCs為均一的“紡錘形”，呈漩渦樣生長(zhǎng)，細(xì)胞熒光化學(xué)染色為CD29()、CD90()、CDll7()、CD34(一)CD45(一)，符合大鼠MSCs的特征。2MSCs與耳蝸Corti氏器細(xì)胞共培養(yǎng)2周后行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定示分化細(xì)胞能表達(dá)毛細(xì)胞的特異性標(biāo)志物Myosin7A、Mathl、Calretinin，其中Myosin7A是目前認(rèn)為特異性比較高的毛細(xì)胞標(biāo)志物，Mathl在毛細(xì)胞形成早期

4、即有表達(dá)一直到成熟期，Calretinin為前庭毛細(xì)胞早期特異性分子標(biāo)志物。3空白對(duì)照組未見毛細(xì)胞標(biāo)志物mRNA的表達(dá)。共培養(yǎng)組可見在Marker為500bp、750bp的電泳條帶之間，出現(xiàn)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為624bp的Myosin7A電泳條帶以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為545bp的Mathl電泳條帶。結(jié)論：1體外已成功將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為具有內(nèi)耳毛細(xì)胞分子特征的毛細(xì)胞樣細(xì)胞。2耳蝸Corti氏器細(xì)胞可能分泌多種調(diào)節(jié)因子，誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞