小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞向內(nèi)耳毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　感音神經(jīng)性耳聾是耳鼻咽喉科常見疾病，研究證實(shí)其病理變化主要是耳蝸毛細(xì)胞及與其相連的螺旋神經(jīng)元的缺失。同時(shí)也有研究顯示哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元受損后再生十分困難。如果能夠找到某種方法修復(fù)缺失的毛細(xì)胞或螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，就有希望治愈感音神經(jīng)性耳聾。2006年，日本科學(xué)家Shinya Yamanaka等通過(guò)導(dǎo)入Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4四個(gè)外源基因?qū)⑿∈篌w細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)。

2、多項(xiàng)研究證實(shí)，iPSCs具有與胚胎干細(xì)胞(ESCs)類似的分化能力，卻可以避免ESCs的免疫排斥及倫理道德問(wèn)題，因此我們將iPSCs在體外誘導(dǎo)分化為耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元，為感音神經(jīng)性耳聾的治療的開辟新的道路。
　　研究?jī)?nèi)容和方法:
　　1.iPSCs的培養(yǎng)與鑒定:取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞作飼養(yǎng)層，iPSCs接種于飼養(yǎng)層上胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察iPSCs生長(zhǎng)狀態(tài)，觀察擬胚體(EB)形成能力，RT-PCR檢測(cè)iPSCs多能

3、性基因Oct4，Nanog，Sox2的表達(dá)情況。
　　2.iPSCs與耳蝸Corti氏器共培養(yǎng)及其分化細(xì)胞的鑒定:分離小鼠耳蝸Corti氏器，將iPSCs與耳蝸Corti氏器共培養(yǎng)。對(duì)分化細(xì)胞用毛細(xì)胞的標(biāo)志物(MyosinⅦA，Math1，Calretinin，Espin)進(jìn)行免疫組化鑒定。
　　3.iPSCs與耳蝸蝸軸共培養(yǎng)及其分化細(xì)胞的鑒定:分離小鼠耳蝸蝸軸，將iPSCs與耳蝸蝸軸共培養(yǎng)，對(duì)分化細(xì)胞用神經(jīng)元的標(biāo)志物(Ne

4、stin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin,Vesicular glutamate transporter1(VGluT1))進(jìn)行免疫組化鑒定。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立穩(wěn)定的iPSCs培養(yǎng)體系，iPSCs體外培養(yǎng)可形成EB。RT-PCR顯示iPSCs表達(dá)多能性基因Oct4，Nanog，Sox2。
　　2.iPSCs與耳蝸Corti氏器共培養(yǎng)18天后可得到表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志蛋白MyosinⅦA，M