豬誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的建立.pdf

1、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）是指通過在分化的體細(xì)胞中表達(dá)特定的轉(zhuǎn)錄因子來誘導(dǎo)其發(fā)生重編程而獲得的可不斷自我更新和具有多向分化潛能的細(xì)胞。iPS細(xì)胞技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，是干細(xì)胞領(lǐng)域乃至整個(gè)生物學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究旨在應(yīng)用限定因子建立豬iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，為將來深入研究應(yīng)用豬iPS細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。論文由三個(gè)試驗(yàn)組成，其內(nèi)容如下：
　　 試驗(yàn)一：攜帶限定因子的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 以胎豬原始生

2、殖嵴和囊胚為材料，用RT-PCR方法克隆出豬Sox2、Klf4和c-Myc基因的開放閱讀框序列，人OCT4基因序列直接從質(zhì)粒pMX-hOCT4中擴(kuò)增獲取。經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1連接，分別構(gòu)建出限定因子EGFP融合蛋白逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。再從重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中擴(kuò)增出CMV啟動(dòng)子，限定因子和EGFP序列，同時(shí)通過酶切從pLL3.7質(zhì)粒中移除U6啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和EGFP序列，最后把擴(kuò)增出的CMV啟動(dòng)子，

3、限定因子和EGFP序列與改造后的pLL3.7進(jìn)行重組，分別構(gòu)建出限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表達(dá)載體pLL-hOCT4/pSox2/pKlf4/pMyc-EGFP。重組慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，在熒光顯微鏡下觀察限定因子表達(dá)情況。結(jié)果顯示，豬Sox2、Klf4和c-Myc基因開放閱讀框序列分別與已發(fā)表的豬Sox2、Klf4和c-Myc基因序列高度同源；重組慢病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表現(xiàn)為限定因子EGFP融合蛋白定位于細(xì)胞

4、核表達(dá)，符合限定因子表達(dá)特點(diǎn)。這些結(jié)果證實(shí)，本試驗(yàn)的限定因子EGFP融合蛋白慢病毒載體構(gòu)建正確。
　　 試驗(yàn)二：慢病毒載體法誘導(dǎo)豬iPS細(xì)胞
　　 采用組織塊培養(yǎng)法從57d胎齡的杜洛克-長(zhǎng)白-大約克三元雜交豬胎兒分離培養(yǎng)建立7株豬胎兒成纖維細(xì)胞系。通過磷酸鈣法轉(zhuǎn)染四種限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒和包裝輔助質(zhì)粒，包裝產(chǎn)生的四種限定因子慢病毒經(jīng)濃縮后感染豬胎兒成纖維細(xì)胞，在含1000U/mL LIF和4ng/m

5、L bFGF的干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)傳代，逐步分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，高倍顯微鏡下集落中的單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核較大，核質(zhì)比例較高。按1∶4比例每3~4d傳代一次，細(xì)胞集落生長(zhǎng)穩(wěn)定，核型正常，AP檢測(cè)為陽性，免疫細(xì)胞化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)有關(guān)鍵性多潛能相關(guān)基因Oct4和Nanog的表達(dá)。此外，細(xì)胞集落中SSEA-1蛋白表達(dá)檢測(cè)陽性，SSEA-3/4和TRA-1-61/81檢測(cè)陰性。將其注射到BALB/cA裸鼠背側(cè)皮下可

6、形成含有外胚層、中胚層和內(nèi)胚層組織來源的畸胎瘤。以上結(jié)果證實(shí)，本試驗(yàn)所獲得的豬的細(xì)胞克隆具有ES細(xì)胞樣特征，即成功地從豬胎兒成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)出iPS細(xì)胞。
　　 試驗(yàn)三：純化蛋白穿膜法誘導(dǎo)豬iPS細(xì)胞
　　 由于慢病毒攜帶外源基因的隨機(jī)穩(wěn)定整合會(huì)帶來潛在的細(xì)胞癌化畸變等危害，因此根據(jù)慢病毒介導(dǎo)外源限定因子EGFP融合蛋白的試驗(yàn)結(jié)果，構(gòu)建攜帶細(xì)胞穿膜肽外源限定因子的融合蛋白用于豬iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)，將會(huì)為豬iPS細(xì)胞的安全生產(chǎn)

7、、應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。將體外表達(dá)、純化的攜帶有細(xì)胞穿膜肽——九聚精氨酸(R9)的限定因子-R9融合蛋白添加到培養(yǎng)的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中嘗試建立豬iPS細(xì)胞。結(jié)果顯示，在熒光顯微鏡下可觀察到限定因子-R9原核蛋白能進(jìn)入豬胎兒成纖維細(xì)胞，且蛋白能定位于細(xì)胞核；在干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下同時(shí)用限定因子-R9原核蛋白處理6個(gè)周期后，能逐漸分離培養(yǎng)出集落邊緣界限清晰的細(xì)胞克隆，重構(gòu)克隆中的單個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞核較大，核質(zhì)比例較高，AP為陽性，免疫細(xì)胞化學(xué)

8、檢測(cè)ES細(xì)胞特異性分子標(biāo)記Oct4和Nanog蛋白表達(dá)陽性。這些結(jié)果證實(shí)本試驗(yàn)的限定因子-R9原核蛋白表達(dá)載體構(gòu)建正確；細(xì)胞穿膜肽R9可轉(zhuǎn)導(dǎo)限定因子重組蛋白進(jìn)入細(xì)胞核；重組限定因子-R9原核蛋白可使豬胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)生重構(gòu)，且重構(gòu)細(xì)胞具有ES細(xì)胞樣形態(tài)，可表達(dá)AP、Oct4和Nanog蛋白。
　　 綜合以上三個(gè)試驗(yàn)的研究結(jié)果，可以得出如下結(jié)論：
　　 1．運(yùn)用RT-PCR技術(shù)可以從胎豬的原始生殖嵴和囊胚細(xì)胞克隆出豬Sox

9、2、Klf4和c-Myc限定因子基因的開放閱讀框序列；用基因工程技術(shù)將這些限定因子基因序列（包括人Oct4基因序列）與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLEGFP-N1連接，再進(jìn)行基因重組，能成功地構(gòu)建限定因子EGFP融合蛋白慢病毒表達(dá)載體。應(yīng)用這些重組限定因子EGFP融合蛋白可有效追蹤掌握限定因子在細(xì)胞重編程過程中的作用機(jī)制和特點(diǎn)。
　　 2．用限定因子EGFP融合蛋白慢病毒能誘導(dǎo)豬胎兒成纖維細(xì)胞重編程，建立豬iPS細(xì)胞。通過限定因子EGFP融

10、合蛋白追蹤發(fā)現(xiàn)，外源限定因子在豬iPS細(xì)胞集落中大多數(shù)不表達(dá)或低水平表達(dá)，少數(shù)細(xì)胞高表達(dá)，提示體細(xì)胞完全重編程形成iPS細(xì)胞后外源基因不表達(dá)，不完全重編程的體細(xì)胞外源基因仍處于高表達(dá)狀態(tài)；不同的豬胎兒成纖維細(xì)胞可能需要不同的時(shí)間去完成重編程進(jìn)程，或者不同的細(xì)胞可能是在不同的時(shí)間點(diǎn)上啟動(dòng)重編程進(jìn)程。
　　 3．將攜帶有細(xì)胞穿膜肽——九聚精氨酸(R9)的限定因子重組蛋白用于豬胎兒成纖維細(xì)胞的重編程，獲得了具有ES細(xì)胞樣形態(tài)、可表達(dá)A