小鼠心臟成纖維細胞誘導為多潛能干細胞的研究.pdf

1、目的:以小鼠心臟成纖維細胞(CFs)為靶點,利用慢病毒載體,向其中導入四個與胚胎干細胞多能性相關的重要轉(zhuǎn)錄因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc),誘導心臟成纖維細胞去分化成為誘導的多能性干細胞(iPS細胞),從而為臨床治療心肌梗死性疾病提供可靠的細胞來源。
　　 方法:
　　 (1)病毒包裝培養(yǎng)工具細胞PlatE,Lip2000試劑盒脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Oct4、Sox2、c-myc、Klf4、GFP和helper質(zhì)粒,

2、包裝得到Oct4-Lentivirus,Sox2-Lentivirus,c-myc-Lentivirus,Klf4-Lentivirus,GFP-Lentivirus病毒(108-109Tu/ml)。用GFP為工具,測定病毒有效生物滴度(病毒量:細胞數(shù)=10:1)。
　　 (2)心臟成纖維細胞分離及培養(yǎng)取內(nèi)源性Oct4-GFP標記的成年轉(zhuǎn)基因C57小鼠,麻醉后,開胸取心臟,剪碎,0.25％胰蛋白酶37℃分次熱消化。含10％胎牛血

3、清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),差速貼壁收集CFs,37℃常規(guī)培養(yǎng)。第3代細胞用于實驗。誘導前以5×104個細胞/孔密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板。
　　 (3)病毒轉(zhuǎn)染以各病毒比例Oct4:Sox2:c-myc:Klf4=1:1:1:1感染CFs,感染6h后,補足全培養(yǎng)基,24h后再次感染。誘導過程中使用iPS細胞專用培養(yǎng)基(無血清DMEM培養(yǎng)基+20％KSR,其余成分同ES細胞培養(yǎng)基)。
　　 (4)細胞形態(tài)學觀察誘導的細胞與飼細

4、胞共培養(yǎng),觀察細胞形態(tài)及生物特性的變化;觀察細胞生長特征及形態(tài);并行堿性磷酸酶染色。
　　 (5)分子生物學測定提取CF細胞、Mef細胞、CF-iPS細胞、Mef-iPS細胞和ES細胞的RNA,實時熒光定量PCR檢測內(nèi)源性多能性因子Oct4、Sox2、Nanog的表達;熒光顯微鏡觀察內(nèi)源性Oct4的GFP表達;Sox2、Nanog行免疫熒光染色鑒定。
　　 (6)細胞多能性檢測在體畸胎瘤(teratoma)生成實驗:所得

5、iPS細胞以106個/部位注射于裸鼠背部皮下,觀察畸胎瘤形成情況并予形態(tài)學檢測。
　　 結(jié)果:
　　 (1)形態(tài)學觀察,CFs呈梭形或多角形,胞體較大,細胞漿透明:細胞核較大,呈橢圓形,可有2～3個核;細胞無自發(fā)性搏動,且分裂增殖旺盛,不易聚集成團,DDR2染色和波形蛋白免疫組化染色結(jié)果陽性,證實為成纖維細胞。
　　 (2)CFs在病毒以有效滴度感染后10-12d,可見部分CFs形態(tài)發(fā)生改變,逐漸形成干細胞樣克隆

6、,陽性克隆挑取傳代后呈ES細胞樣相似的形態(tài)及生長狀態(tài),可見細胞呈集落狀生長,克隆形態(tài)呈島狀或巢狀,克隆和周圍界限明顯,克隆內(nèi)細胞界限不清、排列緊密,細胞表面折光較強。
　　 (3)所得細胞堿性磷酸酶染色陽性;實時熒光定量PCR結(jié)果顯示,CF細胞與Mef細胞的多能性因子mRNA表達均極低,而誘導后產(chǎn)生的iPS細胞顯示出較高的Oct4、Sox2、Nanog mRNA的表達,其表達量與ES細胞及Mef源的iPS無差異;內(nèi)源性Oct4-