白癜風患者成纖維細胞重編程為誘導多功能干細胞的研究.pdf

1、目的：探討在體外將白癜風患者白斑患處成纖維細胞重編程為誘導成多功能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的可能性，并進行形態(tài)學及表觀遺傳學方面的鑒定。
　　方法：
　　①獲得白癜風患者白斑組織，通過貼壁法取得皮損處成纖維細胞（ vitiligo lesional fibroblast, VLF），包裝含有Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉錄因子的逆轉錄病毒，感染 VLF

2、。在顯微鏡下觀察感染病毒后 VLF的形態(tài)變化。誘導至第12天后挑克隆傳代；
　?、趯χ鼐幊坛龅募毎b定：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）染色、細胞免疫熒光檢測干性基因蛋白表達情況，實時熒光定量PCR檢測內源性干性基因表達及外源性四因子表達，OCT4基因啟動子區(qū)域去甲基化檢測，染色體核型分析以及畸胎瘤形成分析試驗。
　　結果：
　　1.重編程白癜風患者誘導多功能干細胞
　?、僦鼐幊踢^程

3、中第4天開始出現(xiàn)ES樣克隆細胞，并且隨培養(yǎng)天數(shù)增加長大，有自我生長能力；
　?、趥鞔蟮腣P-iPS（ vitiligo patient specific-induced pluripotent stem cell, VP-iPS cell）細胞形狀規(guī)則，細胞核排列緊密，細胞可見很高的核質比。
　　2.鑒定白癜風患者誘導多功能干細胞
　　① AP染色顯示VP-iPS細胞為未分化狀態(tài)；
　　②細胞免疫熒光顯示干性基

4、因 OCT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4蛋白水平表達陽性；
　?、?qRT-PCR檢測內源性干性基因Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、Rex1、DNMT3B、GDF3，與陰性對照比較表達水平顯著升高（P＜0.05）,檢測外源性四因子基因與陽性對照比較表達水平顯著下降（P＜0.05）；
　?、苤貋喠蛩猁}測序顯示VP-iPS細胞OCT4基因啟動子區(qū)域為去甲基化狀態(tài)， VLF細胞則為甲基化狀態(tài)；