人胚胎干細胞源性心外膜細胞向心肌成纖維細胞誘導分化.pdf

1、心肌細胞約占心臟總體積的75％，但其細胞數(shù)量只占有心臟細胞總數(shù)的30%-40%。整個心臟約2/3細胞為非心肌細胞，其中絕大多數(shù)為心肌成纖維細胞（CF, cardiac fibroblast）。心肌成纖維細胞能夠分泌細胞外基質(zhì)（ECM）構(gòu)成心臟骨架、傳導機械-電信號、分泌因子促進心肌細胞增殖和冠狀動脈血管生成等。在心肌損傷時，隨著細胞因子侵襲、細胞死亡及炎性物質(zhì)滲透，心肌成纖維細胞被激活轉(zhuǎn)變成肌性成纖維細胞，從而導致細胞外基質(zhì)合成和降解之

2、間的平衡打破，細胞外基質(zhì)的過度合成會導致纖維組織的發(fā)育形成瘢痕組織。因其受限于人類心臟組織的獲取及無有效的心肌成纖維分離方法，對于心肌成纖維細胞在心臟發(fā)育及病理狀態(tài)下功能的研究僅來源于模式研究。體外通過人胚胎干細胞(hESC,human embryonic stem cell)產(chǎn)生心肌成纖維細胞能夠克服這種困難并提供無盡的細胞來源進行體外功能研究及體內(nèi)模型試驗，同時為心臟組織工程提供功能性心肌成纖維細胞奠定了基礎。
　　心肌成纖維

3、細胞主要來源于心外膜細胞。心外膜細胞來源于形成在心房心室環(huán)路形成時的前心外膜器官(PEO，proepicardial organ)。小鼠E10.5、禽類E3、人類發(fā)育第4周，心外膜細胞覆蓋整個心臟表面。心外膜細胞覆蓋整個心臟表層后，部分心外膜細胞進行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT, Epithelial-mesenchymal transition）形成心外膜源性細胞（EPDCs, epicardium-derived cells），并遷移侵襲

4、至心肌細胞層，剩余細胞仍覆蓋在心臟表面。遷移侵入到心肌細胞之間的EPDCs在多種信號通路作用下能夠繼續(xù)分化形成心肌成纖維細胞和血管平滑肌細胞等。心外膜細胞表達特異性標記因子WT1、ALDH1A2和TBX18等，進行EMT形成EPDCs后，其表達水平迅速降低并開始表達EMT標記因子SNAIL1和SNAIL2等，進一步分化形成心肌成纖維細胞表達其特異性標記因子TCF21、DDR2、COL1A1、TBX20、GATA4、POSTN、CD90、

5、HAND2等。心肌成纖維細胞的發(fā)育過程受多種信號通路調(diào)控。研究表明TGFβ，PDGF，Wnt/β-Catenin等促進心外膜細胞進行EMT，Retinoic Acid，F(xiàn)GFs，VEGF等信號通路在EPDCs分化形成心肌成纖維細胞過程中起到重要的調(diào)控作用。目前，尚無研究能夠在體外通過調(diào)節(jié)信號通路誘導分化形成功能性的人心肌成纖維細胞。
　　本研究以人胚胎干細胞為實驗對象，在BMP4和CHIR-99021作用下將其誘導分化形成成熟心外

6、膜細胞，進而研究TGF-β1、PDGFBB和IWP2對心外膜細胞行上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化形成 EPDCs過程中的調(diào)控作用及 bFGF、PDGFBB和SB-431542協(xié)同促進 EPDCs分化形成心肌成纖維細胞的作用。建立兩步誘導將人胚胎干細胞源性心外膜細胞定向誘導分化形成心肌成纖維細胞的體系，并對獲得心肌成纖維細胞功能進行鑒定。
　　本課題針對以上相關(guān)問題從以下四個方面進行研究：第一部分：誘導分化人胚胎干細胞形成成熟心外膜細胞并對其進行鑒

7、定，選取形成成熟心外膜細胞最佳時間，為進一步進行心肌成纖維細胞誘導分化提供正確穩(wěn)定的細胞來源；第二部分：采用不同濃度TGF-β1、PDGFBB和IWP2作用于hESC源性心外膜細胞，選取出最有效促進EMT的濃度組合，并進一步探討進行EMT的最佳時間；第三部分：在第二部分基礎上，采用不同濃度bFGF、PDGFBB和SB-431542作用于 EPDCs，對形成細胞進行鑒定并探討特異性形成心肌成纖維細胞的最佳濃度及時間；第四部分：利用已經(jīng)建立

8、的兩步法特異性誘導hESC源性心外膜細胞分化形成心肌成纖維細胞，對其進行傳代培養(yǎng)，觀察其在傳代過程中的穩(wěn)定性并對其功能進行鑒定。
　　第一部分
　　研究目的：
　　誘導人胚胎干細胞分化形成心外膜細胞，為心肌成纖維細胞誘導分化提供細胞來源。
　　研究方法：
　　采用HESC2-RFP（NIH code ES02）細胞系誘導分化形成心外膜細胞。D0-D1， hESCs在BMP4作用下分化成擬胚體。D1-D4，擬

9、胚體在BMP4和Activin A作用下誘導分化成心臟中胚層。D4-D6，心臟中胚層在BMP4和CHIR-99021特異性誘導分化下形成心外膜前體細胞（P-epi）。D6-D15，心臟中胚層持續(xù)分化增殖形成前體心外膜細胞。D15-D27，前體心外膜細胞增殖形成成熟心外膜細胞(EPI， epicardium)。利用WT1、ALDH1A2和TBX18等心外膜細胞特異性標記因子從細胞分子水平、mRNA表達水平和蛋白表達水平對其進行鑒定。在D1

10、5,D21,D24,D27分別取心外膜前體細胞和心外膜細胞，對其特異性標記的表達水平進行檢測，選取成熟心外膜細胞形成的最佳時期。同時，相同方法分化形成心臟中胚層，D4-D6，VEGF和IWP2特異性誘導心臟中胚層分化為心肌細胞（CM）作為對照。
　　結(jié)果：
　　1. D15 CM,D15 P-epi和D27 EPI表達Aldeflour的陽性細胞率分別為8.64%，16.9%和93.6%；WT1陽性細胞率分別為12.0%,3

11、5.9%和90.4%；CD90陽性細胞率分別為17.6%，62.3%和79.9%；cTNT陽性細胞率分別為72.4%，19.6%和8.5%；
　　2. D15 P-epi和D27 EPI在mRNA水平上表達WT1、ALDH1A2、TBX18、ISL1、CD90、BNC1、ANA8、GPM6A、UPK1B、KRT8和 KRT19等心外膜標記因子，而D15 CM低表達。D15 CM、D15 P-epi和D27EPI均表達TCF21、G

12、ATA4和GATA5。相比較于D15 CM表達心肌細胞標記因子TNNT2和MEF2C，D15 P-epi和D27 EPI細胞不表達；
　　3.免疫熒光結(jié)果顯示D27 EPI細胞核中表達WT1,細胞質(zhì)中不表達cTNT。CD15 CM細胞質(zhì)中表達cTNT，細胞核中不表達WT1；
　　4. D27 EPI高表達心外膜特異性標記因子，是誘導分化形成成熟心外膜細胞的最佳時期。
　　結(jié)論：
　　人胚胎干細胞在BMP4和CHI

13、R-99021作用下，特異性誘導分化形成成熟心外膜細胞。誘導分化形成心外膜細胞穩(wěn)定表達心外膜特異性標記因子，為進一步建立心肌成纖維誘導分化體系提供了基礎。
　　第二部分
　　研究目的：
　　研究TGF-β1、PDGFBB和IWP2是否能夠共同作用調(diào)控hESC源性心外膜細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　研究方法：
　　采用人胚胎干細胞誘導分化形成心外膜細胞為研究對象，不同濃度TGF-β1(0ng/ml、0.1ng/m

14、l、0.3ng/ml、1ng/ml、3ng/ml)，聯(lián)合不同濃度PDGFBB（0ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、30ng/ml）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細胞分子水平檢測心外膜細胞標記因子的表達，進行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細胞會失表達。1ng/ml TGF-β1和1ng/ml PDGFBB組為最佳，但其分化效率有限。在此基礎上，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和不同濃度

15、IWP2（0μM，0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，5μM）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細胞分子水平檢測心外膜細胞標記因子的表達，進行上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細胞會失表達。同時，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB分別和100ng/ml Wnt3a，100ng/ml Wnt5a，150ng/ml DKK1,0.5μM CHIR-99021作用72h對IWP2協(xié)同促進EMT作用進行驗

16、證。1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2組分化效率最高，達到90%以上。從細胞形態(tài)學角度，觀察上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后細胞形態(tài)變化。為了確定EMT最佳時期，1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2組分別作用于hESC源性心外膜細胞24h、48h和72h，通過RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細胞分子水平檢測心外膜細胞標記因子表達水平的變化。免疫熒

17、光染色進一步證實TGF-β1、PDGFBB和IWP2聯(lián)合作用有效促進hESC源性心外膜細胞經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化成EPDCs。
　　結(jié)果：
　　1.單獨采用TGF-β1可促進hESC源性心外膜細胞行EMT，但細胞數(shù)量會明顯下降。1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB聯(lián)合作用能夠促進 EMT，但其分化效率有限；
　　2.1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2為誘導EMT的最佳濃

18、度組合，分化效率達90%以上。Wnt3a，Wnt5a和CHIR-99021不能促進EMT；
　　3.1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2作用后，從形態(tài)學上，卵圓形心外膜細胞轉(zhuǎn)化為細長形間質(zhì)細胞；
　　4.48h為1ng/ml TGF-β1、1ng/ml PDGFBB和0.3μM IWP2誘導EMT的最佳時間；
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)過EMT得到的EPDCs不表達WT1、ZO1

19、和α-SMA，而表達Vemitin。
　　結(jié)論：
　　TGF-β1、PDGFBB和IWP2聯(lián)合作用48h能夠有效促進hESC源性心外膜細胞進行EMT。
　　第三部分
　　研究目的：
　　研究bFGF、PDGFBB和SB-431542是否能夠共同作用調(diào)控hESC源性心外膜細胞形成的EPDCs特異性分化形成心肌成纖維細胞
　　研究方法：
　　采用 hESC源性心外膜細胞經(jīng)EMT后形成的EPDCs為研

20、究對象。在添加和不添加SB-431542的條件下，采用不同濃度bFGF(0ng/ml、3ng/ml、10ng/ml)，聯(lián)合不同濃度PDGFBB（0ng/ml、10ng/ml、30ng/ml）作用72h。RT-PCR從mRNA水平上觀察WT1、ALDH1A2、CD90、MYH11、TCF21和EPOR表達變化。添加SB-431542的條件下，3ng/ml bFGF和10ng/ml PDGFBB組為誘導分化形成心肌成纖維細胞的最佳濃度。進而

21、，采用不同濃度SB-431542（0μM，0.1μM，0.3μM，1μM，3μM，6μM）作用72h。RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細胞分子水平檢測心肌成纖維細胞標記因子的表達。3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB組為誘導EPDCs分化形成心肌成纖維細胞的最佳組合。為了確定心肌成纖維細胞誘導分化最佳時間，3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-4315

22、42組分別作用于 EPDCs24h、48h和72h，通過 RT-PCR和 Flow cytometry從mRNA水平和細胞分子水平檢測特異性心肌成纖維細胞標記因子的表達水平。免疫熒光染色進一步證實bFGF、PDGFBB和SB-431542聯(lián)合作用有效誘導EPDCs分化形成心肌成纖維細胞。
　　結(jié)果：
　　1.3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542組誘導分化形成細胞表達心肌成纖維細胞標

23、記因子 CD90、DDR2、POSTN、Col1A1、TCF21、HAND2、EPOR和GATA4等，不表達WT1、ALDH1A2和MYH11；
　　2.3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB誘導分化形成心肌成纖維細胞中CD90+Aldeflour-細胞占66.5%；
　　3.72h為3ng/ml bFGF、10ng/ml PDGFBB和3μM SB-431542誘導EPDCs分化形成心肌成纖維細

24、胞的最佳時間；
　　4.誘導分化形成心肌成纖維細胞形態(tài)學上為梭形，單個或多個細胞核；
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示誘導分化得到心肌成纖維細胞不表達 WT1、ZO1和α-SMA，而表達Vemitin。
　　結(jié)論：
　　在bFGF、PDGFBB和SB-431542聯(lián)合作用72h下，hESC源性心外膜細胞形成的EPDCs有效分化形成心肌成纖維細胞。
　　第四部分
　　研究目的：
　　研究hESC源性心外膜

25、細胞在體外誘導分化形成的心肌成纖維細胞，是否能夠進行傳代培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)過程中其特性是否發(fā)生改變及對其功能進行鑒定。
　　研究方法：
　　采用 hESC源性心外膜細胞經(jīng)過兩步法誘導分化形成的心肌成纖維細胞為研究對象。待細胞密度達到80%-90%時，進行傳代培養(yǎng)，多次重復此步驟。通過RT-PCR和Flow cytometry從mRNA水平和細胞分子水平檢測心肌成纖維細胞特異性標記因子表達水平。免疫熒光檢測其在蛋白水平表達心肌成纖

26、維細胞標記因子的表達情況。將傳代培養(yǎng)獲得成熟心肌成纖維細胞與人胚胎干細胞誘導分化形成心肌細胞以不同比率共同培養(yǎng)，觀察其相互作用。
　　結(jié)果：
　　1.誘導分化形成心肌成纖維細胞能夠穩(wěn)定傳代，第二代時標記因子表達水平最高；
　　2.心肌成纖維細胞傳代過程中保持形態(tài)學上細長或者梭形，單個或多個細胞核；
　　3.不同代數(shù)心肌成纖維細胞CD90+Aldeflour-細胞百分比均在80%以上；
　　4.不同代數(shù)心肌成

27、纖維細胞在mRNA水平均表達CD90、DDR2、POSTN、Col1A1、TCF21、HAND2和GATA4等，不表達WT1、ALDH1A2，低表達MYH11；
　　5.免疫熒光結(jié)果顯示不同代數(shù)心肌成纖維細胞均不表達 WT1、ZO1和α-SMA，而表達Vemitin；
　　6. hESC源性心外膜細胞表面不表達EPOR，而不同代數(shù)心肌成纖維細胞表面表達EPOR，陽性細胞百分率達50%以上；
　　7.傳代心肌成纖維細胞能