昆白小鼠胚胎干細胞分離克隆及向心肌細胞定向誘導分化的研究.pdf

1、　　本研究從昆白小鼠胚胎中分離克隆出小鼠ES細胞，并對其進行了傳代培養(yǎng)和鑒定；并以ES-D3為材料，采用不同的誘導物將小鼠胚胎干細胞向心肌細胞定向誘導分化。對影響小鼠ES細胞分離與克隆及向心肌細胞定向誘導分化的的影響因素進行了探討，為進一步建立昆白小鼠ES細胞系及建立穩(wěn)定的心肌細胞誘導體系奠定了基礎(chǔ)。實驗主要結(jié)果如下：　　1.從1678枚昆白小鼠胚胎中分離培養(yǎng)ES細胞，ICM形成率為70﹪(1167/1678)，有3株傳至第8代?！?/p>

2、　2.分別比較了桑椹胚，早期囊胚，擴張囊胚，孵化囊胚的貼壁率，生長行為和原代集落出現(xiàn)個數(shù)。結(jié)果表明孵化囊胚是最理想的ICM分離材料?！　?.分別比較了全胚法，免疫外科法，酸處理法，酶消化對ES細胞分離克隆的影響。發(fā)現(xiàn)利用全胚法培養(yǎng)孵化囊胚，是一種可行的ICM分離方法，該方法操作簡單，且能很好的保持ICM的活力，利于傳代。　　4.MEF、STO、HEF及Sertoli在小鼠胚胎貼壁率無顯著差異(P＞0.05)；但在原代集落出現(xiàn)率及傳代

3、率上4者有明顯差異。MEF最好，Sertoli和STO次之，HEF效果最差。　　5.不同培養(yǎng)液對小鼠胚胎貼壁率及ICM集落形成率無明顯影響，ES細胞培養(yǎng)液在ES細胞分離傳代上明顯好于大鼠心肌細胞及肝臟細胞條件培養(yǎng)基(P＜0.05)；大鼠心肌及肝臟條件培養(yǎng)基可用于小鼠ES細胞分離培養(yǎng)；LIF對昆白小鼠ES細胞的分離與克隆具有至關(guān)重要的作用?！　?.0.1﹪膠原酶與0.25﹪胰酶+1﹪雞血清是較好的ES細胞消化液，對細胞損傷力小，且傳代

4、后ES細胞集落形成能力也較高(P＜0.05)。0.05﹪胰酶+0.008﹪EDTA也可用于ES細胞傳代；0.25﹪胰酶+0.04﹪EDTA對ES細胞的損傷較大，不適于小鼠ES細胞的分離與克隆。　　7.分離得到的小鼠ES細胞，AKP染色陽性。0ct-4，SSEA-1染色陽性。體外可自發(fā)分化為上皮樣、神經(jīng)樣、成纖維樣、表明提外培養(yǎng)的ES細胞具有多能性?！　?.比較了小鼠ES細胞在不同條件下分化為心肌的效率。結(jié)果表明單獨使用5-氮胞苷或聯(lián)