胚胎干細胞的分離培養(yǎng)與定向分化研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目前,胚胎干細胞的研究主要集中在分離純化、擴增技術和定向誘導分化幾個方面。本研究以胚胎干細胞作為研究對象,研究內(nèi)容共分以下兩部分: 第一部分主要是豬胚胎生殖細胞(EG)的分離培養(yǎng)研究。本實驗室采用STO細胞作飼養(yǎng)層,在培養(yǎng)基中添加分化抑制因子的方法,已成功分離培養(yǎng)獲得豬的EG細胞。為進一步探索豬EG細胞更為理想的培養(yǎng)體系,并獲得能夠穩(wěn)定傳代的EG細胞系,第一部分以三個實驗展開了對豬EG細胞體外培養(yǎng)條件的進一步研究。 實驗

2、一研究了條件培養(yǎng)基對豬EG細胞分離培養(yǎng)的影響。在原代分離豬PGCs的過程中,可以同時分離獲得豬胎兒成纖維細胞(PEF)和胎兒心臟成纖維細胞(EHF);經(jīng)培養(yǎng)純化后,提取這兩種細胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄;RT-PCR檢測結(jié)果表明,PEF和EHF中均表達豬的LIF基因。因此,分別收集兩種細胞的培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基,用來培養(yǎng)豬的EG細胞。分別使用兩種條件培養(yǎng)基或?qū)l件培養(yǎng)基與STO飼養(yǎng)層細胞聯(lián)合使用來分離培養(yǎng)豬的EG細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基必須與飼

3、養(yǎng)層細胞聯(lián)合使用,才能維持EG細胞的增殖未分化狀態(tài)。 實驗二研究了Knockout培養(yǎng)基對豬EG細胞分離培養(yǎng)的影響。本實驗共分三組,其中實驗組Ⅰ為KnockoutDMEM與KnockoutSR組成的Knockout培養(yǎng)基,實驗組Ⅱ為KnockoutDMEMF-12+15%FCS的低滲培養(yǎng)基,對照組為DMEM+15%FCS的普通培養(yǎng)基,三個實驗組中均添加了細胞生長因子。結(jié)果表明實驗組Ⅰ與對照組都可以獲得能夠傳代的EG細胞,實驗組Ⅰ

4、培養(yǎng)效果好于對照組;而實驗組Ⅱ不能維持EG細胞穩(wěn)定傳代。因此,KnockoutDMEM與KnockoutSR組成的Knockout培養(yǎng)基可以用于分離培養(yǎng)豬的EG細胞。 實驗三將PGCs與同源胎兒成纖維細胞共培養(yǎng)分離培養(yǎng)豬的EG細胞。培養(yǎng)獲得的細胞經(jīng)AKP染色,SSEA-1免疫熒光染色,轉(zhuǎn)錄因子Oct-4免疫熒光表達,核型分析,體外分化實驗及電鏡觀察等多種方法進行鑒定,證明其具有胚胎干細胞的特征。因此,PGCs與同源胎兒成纖維細胞

5、共培養(yǎng)的方法可以用于分離培養(yǎng)豬EG細胞。 第二部分以小鼠ES細胞作為研究對象,分三個實驗對不同誘導劑在胚胎干細胞定向分化為胰島素分泌細胞(IPCs)中的作用以及基因轉(zhuǎn)染方法誘導ES細胞分化為IPCs進行了初步探討。 實驗一研究了GLP-1在誘導小鼠ES細胞向IPCs分化中的作用。誘導一周后,經(jīng)DTZ染色鑒定,陽性細胞很少;誘導兩周后,提取細胞總RNA,經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),GLP-1可以使與胰腺發(fā)育相關的重要基因Pdx

6、1的表達量上調(diào),但誘導兩周仍未能獲得大量IPCs。 實驗二研究了bFGF在誘導小鼠ES細胞向IPCs分化中的作用。誘導后提取細胞總RNA,通過RT-PCR未能檢測到IPCs相關基因的表達。實驗結(jié)果表明,在本實驗條件下,向培養(yǎng)基中單一添加bFGF并不能有效地誘導小鼠ES細胞向IPCs分化。 實驗三采用基因轉(zhuǎn)染的方法將Pdx1基因與Isl1基因?qū)胄∈驟S細胞誘導其分化。轉(zhuǎn)染24h后,通過RT-PCR的方法檢測到Pdx1基因

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