胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)與定向分化研究.pdf

1、目前，胚胎干細(xì)胞的研究主要集中在分離純化、擴(kuò)增技術(shù)和定向誘導(dǎo)分化幾個(gè)方面。本研究以胚胎干細(xì)胞作為研究對象，研究內(nèi)容共分以下兩部分： 第一部分主要是豬胚胎生殖細(xì)胞(EG)的分離培養(yǎng)研究。本實(shí)驗(yàn)室采用STO細(xì)胞作飼養(yǎng)層，在培養(yǎng)基中添加分化抑制因子的方法，已成功分離培養(yǎng)獲得豬的EG細(xì)胞。為進(jìn)一步探索豬EG細(xì)胞更為理想的培養(yǎng)體系，并獲得能夠穩(wěn)定傳代的EG細(xì)胞系，第一部分以三個(gè)實(shí)驗(yàn)展開了對豬EG細(xì)胞體外培養(yǎng)條件的進(jìn)一步研究。 實(shí)驗(yàn)

2、一研究了條件培養(yǎng)基對豬EG細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。在原代分離豬PGCs的過程中，可以同時(shí)分離獲得豬胎兒成纖維細(xì)胞(PEF)和胎兒心臟成纖維細(xì)胞(EHF)；經(jīng)培養(yǎng)純化后，提取這兩種細(xì)胞的RNA并反轉(zhuǎn)錄；RT-PCR檢測結(jié)果表明，PEF和EHF中均表達(dá)豬的LIF基因。因此，分別收集兩種細(xì)胞的培養(yǎng)液制成條件培養(yǎng)基，用來培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞。分別使用兩種條件培養(yǎng)基或?qū)l件培養(yǎng)基與STO飼養(yǎng)層細(xì)胞聯(lián)合使用來分離培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)條件培養(yǎng)基必須與飼

3、養(yǎng)層細(xì)胞聯(lián)合使用，才能維持EG細(xì)胞的增殖未分化狀態(tài)。 實(shí)驗(yàn)二研究了Knockout培養(yǎng)基對豬EG細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。本實(shí)驗(yàn)共分三組，其中實(shí)驗(yàn)組Ⅰ為KnockoutDMEM與KnockoutSR組成的Knockout培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組Ⅱ?yàn)镵nockoutDMEMF-12+15％FCS的低滲培養(yǎng)基，對照組為DMEM+15％FCS的普通培養(yǎng)基，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組中均添加了細(xì)胞生長因子。結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組Ⅰ與對照組都可以獲得能夠傳代的EG細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ

4、培養(yǎng)效果好于對照組；而實(shí)驗(yàn)組Ⅱ不能維持EG細(xì)胞穩(wěn)定傳代。因此，KnockoutDMEM與KnockoutSR組成的Knockout培養(yǎng)基可以用于分離培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)三將PGCs與同源胎兒成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)分離培養(yǎng)豬的EG細(xì)胞。培養(yǎng)獲得的細(xì)胞經(jīng)AKP染色，SSEA-1免疫熒光染色，轉(zhuǎn)錄因子Oct-4免疫熒光表達(dá)，核型分析，體外分化實(shí)驗(yàn)及電鏡觀察等多種方法進(jìn)行鑒定，證明其具有胚胎干細(xì)胞的特征。因此，PGCs與同源胎兒成纖維細(xì)胞

5、共培養(yǎng)的方法可以用于分離培養(yǎng)豬EG細(xì)胞。 第二部分以小鼠ES細(xì)胞作為研究對象，分三個(gè)實(shí)驗(yàn)對不同誘導(dǎo)劑在胚胎干細(xì)胞定向分化為胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)中的作用以及基因轉(zhuǎn)染方法誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為IPCs進(jìn)行了初步探討。 實(shí)驗(yàn)一研究了GLP-1在誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向IPCs分化中的作用。誘導(dǎo)一周后，經(jīng)DTZ染色鑒定，陽性細(xì)胞很少；誘導(dǎo)兩周后，提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，GLP-1可以使與胰腺發(fā)育相關(guān)的重要基因Pdx

6、1的表達(dá)量上調(diào)，但誘導(dǎo)兩周仍未能獲得大量IPCs。 實(shí)驗(yàn)二研究了bFGF在誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向IPCs分化中的作用。誘導(dǎo)后提取細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR未能檢測到IPCs相關(guān)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，向培養(yǎng)基中單一添加bFGF并不能有效地誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向IPCs分化。 實(shí)驗(yàn)三采用基因轉(zhuǎn)染的方法將Pdx1基因與Isl1基因?qū)胄∈驟S細(xì)胞誘導(dǎo)其分化。轉(zhuǎn)染24h后，通過RT-PCR的方法檢測到Pdx1基因