胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及其向間質(zhì)干細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)、凍存、復(fù)蘇小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouseembryonic fibroblasts,MEF),并對其生物學(xué)特性進行研究。以MEF作為飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hESC)。探討hESC定向分化為間質(zhì)干細(xì)胞的方法與機制,初步研究人胚胎干細(xì)胞來源的間質(zhì)干細(xì)胞(human embryonic stem cell-derivedmesenchymal stem cells

2、,hESC-MSCs)的基本生物學(xué)特性。
　　 方法：用0.083％、0.125％、0.25％的胰酶分步消化組織塊分離培養(yǎng)MEF,對MEF形態(tài)、生長曲線、細(xì)胞周期、貼壁率、細(xì)胞化學(xué)染色、凍存與復(fù)蘇等特性進行觀察研究。以3代以內(nèi)的MEF作為飼養(yǎng)層培養(yǎng)、傳代hESC,觀察其未分化特性。分別用機械法、擬胚體法分離、培養(yǎng)、純化hESC-MSCs,對其形態(tài)、生長特性進行觀察,用流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光檢測細(xì)胞表面標(biāo)記,核型分析檢測其染色體,細(xì)

3、胞化學(xué)染色觀察其生物化學(xué)特性,RT—PCR測定相關(guān)基因的表達情況。并用絲裂霉素處理,觀察其作為飼養(yǎng)層支持hESC生長的能力。
　　 結(jié)果：胰酶分步消化法獲得的MEF為長梭形,凍存復(fù)蘇后的MEF在體外培養(yǎng)30min時80％以上細(xì)胞貼壁,生長曲線顯示細(xì)胞增殖活躍,細(xì)胞化學(xué)染色AKP、PAS、POX陰性。hESC在MEF飼養(yǎng)層上傳30代以上其形態(tài)保持不變,AKP染色陽性,具有自發(fā)分化形成擬胚體的能力。機械法、擬胚體分化法共得到3株hE

4、SC-MSCs,其形態(tài)一致,呈細(xì)長梭形,體積較大,與骨髓間質(zhì)干細(xì)胞相似；hESC-MSCs生長曲線顯示細(xì)胞增殖較快,第3天生長速度開始加快,第7天達到高峰；細(xì)胞化學(xué)染色顯示AKP、POX為陰性,PAS為弱陽性；流式分析表面標(biāo)記顯示hESC-MSCs表達CD29、CD44、CD13,但不表達CD14、CD31、CD34、CD45、HLA-DR；hESC-MSCs核型仍然為46,XY；hESC-MSCs表達間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)基因nucleost

5、emin、TGF-β、N-cadherin、sall-4、snail、twist,不表達上皮細(xì)胞相關(guān)基因E-cadherin。作為飼養(yǎng)層可以支持hESC生長。
　　 結(jié)論：胰酶分步消化法是分離MEF的較好方法,此方法所獲得的MEF經(jīng)凍存復(fù)蘇后有較高的生物學(xué)活性,可支持hESC傳代、培養(yǎng),并保持hESC未分化特性。hESC在體外能分化為間質(zhì)干細(xì)胞,hESC-MSCs在細(xì)胞形態(tài)、生長方式、細(xì)胞表面標(biāo)記、基因表達等方面符合間質(zhì)干細(xì)胞的