共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、目的:探討軟骨共培養(yǎng)體系誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的可行性。 方法:實(shí)驗(yàn)使用兩種不同的小鼠胚胎干細(xì)胞(ES cell)細(xì)胞株(E7及R1)。在第一部分，綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的E7 ES細(xì)胞初步分化，得到第4天胚體(EB)。將EB消化為單個(gè)細(xì)胞后，同豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按一定比例(1: 3)混合后接種于聚乳酸一聚經(jīng)基乙酸復(fù)合生物材料(PLGA)，經(jīng)短期體外培養(yǎng)后植入裸鼠皮下7周取材。對(duì)照組為單純EB細(xì)胞接種組。取材檢測(cè)標(biāo)本內(nèi)軟

2、骨形成情況及EB細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。實(shí)驗(yàn)第二部分，分為休內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)部分。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，將R1 ES細(xì)胞第4天胚體(EB)消化得到的單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分選后得到Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞及Flk-1陰性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組為Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞同豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞按一定比例(1: 3)混合后接種于聚乳酸一經(jīng)基乙酸復(fù)合生物材料(PLGA), Flk-1陰性細(xì)胞及未分選細(xì)胞同豬軟骨細(xì)胞混合后植入作為對(duì)照組。取材后行連續(xù)切片，切片分別做1E染色、藏紅花染色、熒

3、光拍照、抗二型膠原(anti-human collagen 11)免疫熒光染色及抗小鼠主要組織相容性抗原(anti-mouseMHC)免疫熒光染色。前兩種染色主要是顯示標(biāo)本內(nèi)軟骨生成情況，后兩種染色主要顯示軟骨組織來(lái)源。體外實(shí)驗(yàn)中，將分選后的Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞離心后形成小球(pellet)，分別用軟骨條件培養(yǎng)液及軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)4周。對(duì)照組為F1k-1陰性細(xì)胞及未分選細(xì)胞制作成小球，用同樣的方法培養(yǎng)4周。檢測(cè)方法包括HE染色及抗二型膠原(

4、anti-human collagen II)免疫熒光染色，檢測(cè)標(biāo)本內(nèi)軟骨生成情況。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)第一部分的結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組形成軟骨組織和畸胎瘤的混合體。甲苯胺藍(lán)染色、HE染色結(jié)果和熒光照片及anti-mouse MHC免疫熒光照片結(jié)果對(duì)照后顯示，標(biāo)本內(nèi)部分軟骨細(xì)胞由小鼠ES細(xì)胞分化而來(lái)。對(duì)照組單純EB細(xì)胞接種后形成畸胎瘤，很少有軟骨組織生成；實(shí)驗(yàn)第二部分體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組Flk-1陽(yáng)性細(xì)胞同軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，得到的標(biāo)本大

5、體觀為白色透明的軟骨組織。未見(jiàn)畸胎瘤形成。染色結(jié)果顯示，除了少量的成纖維樣細(xì)胞構(gòu)成的松散組織，標(biāo)本內(nèi)主要由軟骨組織構(gòu)成。anti-mouse MHC免疫熒光染色顯示，標(biāo)本內(nèi)部分軟骨細(xì)胞來(lái)自小鼠ES細(xì)胞。對(duì)照組F1k-1陰性細(xì)胞同軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，得到軟骨組織同畸胎瘤的混合體。標(biāo)本內(nèi)軟骨細(xì)胞少有anti-mouse MHC免疫熒光染色陽(yáng)性。另外一對(duì)照組未分選細(xì)胞同軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，標(biāo)本大體觀為白色透明的軟骨組織，未見(jiàn)畸胎瘤形成。內(nèi)主要由軟骨組

6、織構(gòu)成，有少量軟骨細(xì)胞anti-mouse MHC免疫熒光染色陽(yáng)性。第二部分的體外實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)1k-1陽(yáng)性細(xì)胞形成的小球，在軟骨條件培養(yǎng)液、或軟骨誘導(dǎo)液的誘導(dǎo)作用下，分泌基質(zhì)旺盛，并形成軟骨陷窩結(jié)構(gòu)。Flk-1陰性細(xì)胞在相同的培養(yǎng)體系內(nèi)，形成雜亂的成纖維樣結(jié)構(gòu)。未分選的EB細(xì)胞形成軟骨樣結(jié)構(gòu)同成纖維樣結(jié)構(gòu)的混合體。 結(jié)論：軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系，使用于E7細(xì)胞系時(shí)，雖然不能使小鼠EB細(xì)胞全部向軟骨細(xì)胞分化，但可以誘導(dǎo)部分EB細(xì)胞向