人胚胎干細胞向原始精原細胞誘導分化的機制研究.pdf

1、獲得早期發(fā)育人原始精原細胞對于研究精子發(fā)生過程及深入研究男性不育的病理機制具有重要意義。但是由于取材困難，在體研究的不安全性及倫理限制等問題使其一直成為困擾學者研究的難題。自1998年第一株人胚胎干細胞（hESCs，human embryonic stem cells）成功建系以來，鑒于其在體外有無限增殖、自我更新及向各類細胞分化的特性，有關它的多潛能性維持與誘導分化的機制研究得到許多學者的關注。因此，體外通過誘導人胚胎干細胞向精原細胞

2、分化進而探索原始精原細胞發(fā)育的過程，不僅可以避免上述諸多問題的困擾，而且對于我們深入認識精子發(fā)生與男性不育，同時為臨床藥物的研發(fā)及篩選建立可靠模型等工作的開展提供堅實的理論依據。
　　目前雖已有文獻報道將hESCs誘導成原始精原細胞的研究，這其中包括有添加誘導分化因子，比如骨形態(tài)生成蛋白4（BMP4, bone morphogenetic protein4）、BMP7、 BMP8b、干細胞因子（SCF, stem cell fac

3、tor）、表皮生長因子（EGF, epidermal growth factor）、神經膠質源性神經營養(yǎng)因子（ GDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor）及視黃酸（RA, retinoic acid）等，或者與人源/鼠源睪丸基質細胞來源的條件培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)，亦有通過在hESCs中過表達DAZL或者VASA(也稱作DDX4)進而聯(lián)合誘導分化因子等方法。但是這些方法因為存在有誘導步

4、驟繁瑣，重復性差，周期過長，機制不清楚或者由于慢病毒載體本身帶來的安全問題等尚存在一定的爭議與討論。
　　2012年，有學者使用小分子化合物（small molecular compound）對小鼠成纖維細胞進行重編成為化學藥物誘導的多潛能干細胞（CiPSCs, chemically induced piuripotent stem cells），當時引起國內外學者的廣泛關注與討論。CHIR99021作為其中之一，是常見的糖原合成

5、激酶（GSK3, glycogen synthase kinase3）的抑制劑，近年來被報道在參與胚胎干細胞多潛能性維持方面，或者促進胚胎干細胞/誘導多潛能干細胞（iPSCs, induced pluripotent stem cells）體外向心肌細胞，腎源性細胞，原始的腎臟近端管狀細胞等中內胚層的分化過程中均起著重要的調節(jié)作用。視黃酸（RA, retinoic acid）是由維生素A氧化代謝產生的一種具有生物活性的產物，在細胞的增殖

6、與分化、器官形成及內穩(wěn)態(tài)的平衡（視力調節(jié)、生殖系統(tǒng)、免疫反應）等生命活動中發(fā)揮著關鍵的調控作用。在體實驗研究表明RA在精子發(fā)生過程及調控減數分裂的發(fā)生中均起著重要的誘導功能。同樣體外RA在hESCs或者是iPSCs向原始精原細胞方向的誘導分化中也發(fā)揮著不可替代的作用。目前尚沒有聯(lián)合CHIR99021和RA促進hESCs向原始精原細胞的誘導分化的相關報道。
　　近年來有學者報道Wnt信號通路對于哺乳動物睪丸的發(fā)育過程中起著重要的作用

7、，其中包括對PGCs的特定化、增殖、遷移、精原干細胞（SSCs， spermatogonia stem cells）的維持及精子發(fā)生過程調控均有緊密的關系。但是對于體外誘導原始精原分化過程中，Wnt信號通路是否有參與及如何發(fā)揮作用目前尚沒有相關報道。
　　本文就上述研究的熱點和難點問題從以下三個方面進行相關研究：第一部分：小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視黃酸（retinoic acid）作用于hESCs促進原始精原細胞的產

8、生及單倍體細胞的出現；第二部分：Wnt/β-catenin信號通路在CHIR99021誘導胚胎干細胞向原始精原細胞分化中的作用；第三部分：IWR-1阻斷由CHIR99021與RA聯(lián)合誘導胚胎干細胞向原始精原細胞分化。
　　第一部分：小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視黃酸（retinoic acid）作用于hESCs促進原始精原細胞產生及單倍體細胞的出現
　　目的：
　　檢測小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視

9、黃酸（retinoic acid）對于體外hESCs向原始精原細胞誘導分化的作用。
　　方法：
　　通過immunofluorescence，western blotting，flow cytometry，Real-time-qPCR, synaptonemal complex protein(SCP) straining, fluorescence in situ hybridization(FISH)的方法，探索CHIR

10、99021聯(lián)合RA以不同的作用順序及作用時間對hESCs向精原細胞的誘導分化中的過程的影響。
　　結果：
　　1.細胞免疫熒光染色實驗結果表明8μM的CHIR99021作用于hESCs3天時間之后，單獨添加9天的2μM RA作用的序貫培養(yǎng)方法及聯(lián)合12天8μM CHIR99021與2μM RA共同作用的方法在促進DAZL蛋白的表達效果是顯著的。
　　2.通過Real-time-qPCR的方法直接證實上述兩組誘導方法的組

11、合使DDX4、Blimp1、Nanos、TFAP2C基因在 mRNA水平的表達明顯增高,western blotting也證實DDX4蛋白的表達量相比較于未分化組顯著增多。另外頂體蛋白-中間體（acrosin-intermediate）的表達量也是呈現顯著增加。同時β-catenin在兩組中的表達量也是呈現明顯增多的。通過流式細胞術分析 DAZL，c-Kit，CXC趨化因子受體4（CXCR4）陽性細胞數都是呈現顯著升高。
　　3.

12、采用聯(lián)會絲復合體蛋白（synaptonemal complex protein, SCP3）細胞免疫熒光染色的方法證實點狀的SCP3蛋白的表達量顯著高于對照組；同時熒光原位雜交技術（ fluorescence in situ hybridization, FISH）證實使用常染色體探針（Chr16/22）檢測兩個誘導組均出現單倍體細胞。
　　結論：
　　3 d CHIR99021聯(lián)合9 d RA和12 d CHIR99021

13、與RA共培養(yǎng)的方法對于促進人胚胎干細胞體外定向分化為原始精原細胞分化有明顯作用，另外該方法可達到體外向更為成熟的減數分裂期及單倍體細胞形成的水平。
　　第二部分 Wnt/β-catenin信號通路在CHIR99021誘導胚胎干細胞向原始精原細胞分化中的作用
　　目的：
　　探索使用CHIR99021與RA在促進hESCs向原始精原細胞誘導分化的機理。
　　方法：
　　采用immunofluorescence

14、的方法，檢測hESCs在添加CHIR99021第0天和第3天OCT4與β-catenin的熒光強度所發(fā)生的變化。同時采用PCR Array實驗方法檢測Wnt信號通路中相關基因的表達水平。
　　結果：
　　相比較于第0天hESCs的OCT4熒光強度，作用3天CHIR99021之后的hESCs發(fā)生明顯的降低，這說明 hESCs已經發(fā)生了分化，在作用3天的CHIR99021的hESCs組中，統(tǒng)計有40％的細胞中β-catenin發(fā)

15、生入核。通過對兩個誘導組與未分化組之間進行PCR array比較分析后發(fā)現，發(fā)現APC、Axin1、Axin2表達量呈現下調表達，其中WNT10A、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT9A顯著上調表達， TCF7作為Wnt-β-catenin胞內重要元件，在該過程中呈現顯著上調表達。
　　結論：
　　β-catenin在作用3天CHIR99021的hESCs發(fā)生明顯的

16、入核現象充分說明經典Wnt/β-catenin信號通路被激活，PCR Array分析實驗更加佐證該結論。
　　第三部分 IWR-1阻斷由CHIR99021與RA聯(lián)合誘導干細胞向原始精原細胞分化
　　目的：
　　采用Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑IWR-1作用于上述誘導組中，進而檢測在該誘導方法下β-catenin是否發(fā)生明顯的入核現象及是否有DAZL陽性細胞的出現。
　　方法：
　　采用細胞免疫

17、熒光的化學方法進行檢測在IWR-1分別作用于3天CHIR99021及12天CHIR99021與RA共培養(yǎng)組進而觀察β-catenin和DAZL的熒光變化情況。
　　結果：
　　相比較于未分化hESCs，OCT4的熒光強度在3d CHIR99021+IWR-1共培養(yǎng)組發(fā)生明顯降低，同時β-catenin并未發(fā)生入核，同時，相比較與12d CHIR99021+RA共培養(yǎng)組，DAZL蛋白并未在12d CHIR99021+RA+IW