人胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)制研究.pdf

1、獲得早期發(fā)育人原始精原細(xì)胞對于研究精子發(fā)生過程及深入研究男性不育的病理機(jī)制具有重要意義。但是由于取材困難，在體研究的不安全性及倫理限制等問題使其一直成為困擾學(xué)者研究的難題。自1998年第一株人胚胎干細(xì)胞（hESCs，human embryonic stem cells）成功建系以來，鑒于其在體外有無限增殖、自我更新及向各類細(xì)胞分化的特性，有關(guān)它的多潛能性維持與誘導(dǎo)分化的機(jī)制研究得到許多學(xué)者的關(guān)注。因此，體外通過誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向精原細(xì)胞

2、分化進(jìn)而探索原始精原細(xì)胞發(fā)育的過程，不僅可以避免上述諸多問題的困擾，而且對于我們深入認(rèn)識精子發(fā)生與男性不育，同時(shí)為臨床藥物的研發(fā)及篩選建立可靠模型等工作的開展提供堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。
　　目前雖已有文獻(xiàn)報(bào)道將hESCs誘導(dǎo)成原始精原細(xì)胞的研究，這其中包括有添加誘導(dǎo)分化因子，比如骨形態(tài)生成蛋白4（BMP4, bone morphogenetic protein4）、BMP7、 BMP8b、干細(xì)胞因子（SCF, stem cell fac

3、tor）、表皮生長因子（EGF, epidermal growth factor）、神經(jīng)膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（ GDNF, glial cell line-derived neurotrophic factor）及視黃酸（RA, retinoic acid）等，或者與人源/鼠源睪丸基質(zhì)細(xì)胞來源的條件培養(yǎng)基進(jìn)行共培養(yǎng)，亦有通過在hESCs中過表達(dá)DAZL或者VASA(也稱作DDX4)進(jìn)而聯(lián)合誘導(dǎo)分化因子等方法。但是這些方法因?yàn)榇嬖谟姓T導(dǎo)步

4、驟繁瑣，重復(fù)性差，周期過長，機(jī)制不清楚或者由于慢病毒載體本身帶來的安全問題等尚存在一定的爭議與討論。
　　2012年，有學(xué)者使用小分子化合物（small molecular compound）對小鼠成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編成為化學(xué)藥物誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞（CiPSCs, chemically induced piuripotent stem cells），當(dāng)時(shí)引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注與討論。CHIR99021作為其中之一，是常見的糖原合成

5、激酶（GSK3, glycogen synthase kinase3）的抑制劑，近年來被報(bào)道在參與胚胎干細(xì)胞多潛能性維持方面，或者促進(jìn)胚胎干細(xì)胞/誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（iPSCs, induced pluripotent stem cells）體外向心肌細(xì)胞，腎源性細(xì)胞，原始的腎臟近端管狀細(xì)胞等中內(nèi)胚層的分化過程中均起著重要的調(diào)節(jié)作用。視黃酸（RA, retinoic acid）是由維生素A氧化代謝產(chǎn)生的一種具有生物活性的產(chǎn)物，在細(xì)胞的增殖

6、與分化、器官形成及內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡（視力調(diào)節(jié)、生殖系統(tǒng)、免疫反應(yīng)）等生命活動中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在體實(shí)驗(yàn)研究表明RA在精子發(fā)生過程及調(diào)控減數(shù)分裂的發(fā)生中均起著重要的誘導(dǎo)功能。同樣體外RA在hESCs或者是iPSCs向原始精原細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化中也發(fā)揮著不可替代的作用。目前尚沒有聯(lián)合CHIR99021和RA促進(jìn)hESCs向原始精原細(xì)胞的誘導(dǎo)分化的相關(guān)報(bào)道。
　　近年來有學(xué)者報(bào)道Wnt信號通路對于哺乳動物睪丸的發(fā)育過程中起著重要的作用

7、，其中包括對PGCs的特定化、增殖、遷移、精原干細(xì)胞（SSCs， spermatogonia stem cells）的維持及精子發(fā)生過程調(diào)控均有緊密的關(guān)系。但是對于體外誘導(dǎo)原始精原分化過程中，Wnt信號通路是否有參與及如何發(fā)揮作用目前尚沒有相關(guān)報(bào)道。
　　本文就上述研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題從以下三個(gè)方面進(jìn)行相關(guān)研究：第一部分：小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視黃酸（retinoic acid）作用于hESCs促進(jìn)原始精原細(xì)胞的產(chǎn)

8、生及單倍體細(xì)胞的出現(xiàn)；第二部分：Wnt/β-catenin信號通路在CHIR99021誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化中的作用；第三部分：IWR-1阻斷由CHIR99021與RA聯(lián)合誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化。
　　第一部分：小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視黃酸（retinoic acid）作用于hESCs促進(jìn)原始精原細(xì)胞產(chǎn)生及單倍體細(xì)胞的出現(xiàn)
　　目的：
　　檢測小分子化合物（CHIR99021）聯(lián)合視

9、黃酸（retinoic acid）對于體外hESCs向原始精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用。
　　方法：
　　通過immunofluorescence，western blotting，flow cytometry，Real-time-qPCR, synaptonemal complex protein(SCP) straining, fluorescence in situ hybridization(FISH)的方法，探索CHIR

10、99021聯(lián)合RA以不同的作用順序及作用時(shí)間對hESCs向精原細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中的過程的影響。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8μM的CHIR99021作用于hESCs3天時(shí)間之后，單獨(dú)添加9天的2μM RA作用的序貫培養(yǎng)方法及聯(lián)合12天8μM CHIR99021與2μM RA共同作用的方法在促進(jìn)DAZL蛋白的表達(dá)效果是顯著的。
　　2.通過Real-time-qPCR的方法直接證實(shí)上述兩組誘導(dǎo)方法的組

11、合使DDX4、Blimp1、Nanos、TFAP2C基因在 mRNA水平的表達(dá)明顯增高,western blotting也證實(shí)DDX4蛋白的表達(dá)量相比較于未分化組顯著增多。另外頂體蛋白-中間體（acrosin-intermediate）的表達(dá)量也是呈現(xiàn)顯著增加。同時(shí)β-catenin在兩組中的表達(dá)量也是呈現(xiàn)明顯增多的。通過流式細(xì)胞術(shù)分析 DAZL，c-Kit，CXC趨化因子受體4（CXCR4）陽性細(xì)胞數(shù)都是呈現(xiàn)顯著升高。
　　3.

12、采用聯(lián)會絲復(fù)合體蛋白（synaptonemal complex protein, SCP3）細(xì)胞免疫熒光染色的方法證實(shí)點(diǎn)狀的SCP3蛋白的表達(dá)量顯著高于對照組；同時(shí)熒光原位雜交技術(shù)（ fluorescence in situ hybridization, FISH）證實(shí)使用常染色體探針（Chr16/22）檢測兩個(gè)誘導(dǎo)組均出現(xiàn)單倍體細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　3 d CHIR99021聯(lián)合9 d RA和12 d CHIR99021

13、與RA共培養(yǎng)的方法對于促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞體外定向分化為原始精原細(xì)胞分化有明顯作用，另外該方法可達(dá)到體外向更為成熟的減數(shù)分裂期及單倍體細(xì)胞形成的水平。
　　第二部分 Wnt/β-catenin信號通路在CHIR99021誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化中的作用
　　目的：
　　探索使用CHIR99021與RA在促進(jìn)hESCs向原始精原細(xì)胞誘導(dǎo)分化的機(jī)理。
　　方法：
　　采用immunofluorescence

14、的方法，檢測hESCs在添加CHIR99021第0天和第3天OCT4與β-catenin的熒光強(qiáng)度所發(fā)生的變化。同時(shí)采用PCR Array實(shí)驗(yàn)方法檢測Wnt信號通路中相關(guān)基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　相比較于第0天hESCs的OCT4熒光強(qiáng)度，作用3天CHIR99021之后的hESCs發(fā)生明顯的降低，這說明 hESCs已經(jīng)發(fā)生了分化，在作用3天的CHIR99021的hESCs組中，統(tǒng)計(jì)有40％的細(xì)胞中β-catenin發(fā)

15、生入核。通過對兩個(gè)誘導(dǎo)組與未分化組之間進(jìn)行PCR array比較分析后發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)APC、Axin1、Axin2表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)，其中WNT10A、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT9A顯著上調(diào)表達(dá)， TCF7作為Wnt-β-catenin胞內(nèi)重要元件，在該過程中呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　β-catenin在作用3天CHIR99021的hESCs發(fā)生明顯的

16、入核現(xiàn)象充分說明經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路被激活，PCR Array分析實(shí)驗(yàn)更加佐證該結(jié)論。
　　第三部分 IWR-1阻斷由CHIR99021與RA聯(lián)合誘導(dǎo)干細(xì)胞向原始精原細(xì)胞分化
　　目的：
　　采用Wnt/β-catenin信號通路的抑制劑IWR-1作用于上述誘導(dǎo)組中，進(jìn)而檢測在該誘導(dǎo)方法下β-catenin是否發(fā)生明顯的入核現(xiàn)象及是否有DAZL陽性細(xì)胞的出現(xiàn)。
　　方法：
　　采用細(xì)胞免疫

17、熒光的化學(xué)方法進(jìn)行檢測在IWR-1分別作用于3天CHIR99021及12天CHIR99021與RA共培養(yǎng)組進(jìn)而觀察β-catenin和DAZL的熒光變化情況。
　　結(jié)果：
　　相比較于未分化hESCs，OCT4的熒光強(qiáng)度在3d CHIR99021+IWR-1共培養(yǎng)組發(fā)生明顯降低，同時(shí)β-catenin并未發(fā)生入核，同時(shí)，相比較與12d CHIR99021+RA共培養(yǎng)組，DAZL蛋白并未在12d CHIR99021+RA+IW