人胚胎干細胞向血管內皮細胞的誘導分化及后者遷移機制的研究.pdf

1、本研究的目的是探討人胚胎干細胞(hESC)向造血～內皮系誘導分化的能力，將hESC定向分化為高純度的hESC來源內皮細胞，為hESC應用于構建組織工程血管提供依據(jù)。以hESC作為研究載體，建立模仿人胚胎發(fā)育過程中血管生成的芽生EB模型，探究SDF—l／CXCR4軸對人類胚胎干細胞來源內皮細胞的遷移和血管生成的影響。 結果：1．未分化hESC集落表現(xiàn)為圓形或橢圓形、平坦、細胞排列緊密的細胞團，表達SSEA-4、TRA-1-60、T

2、RA-1-81等未分化hESC的特異性標志，但不表達SSEA一1。隨著細胞分化程度的提高，SSEA-4的表達逐漸減弱，而SSEA-1的表達進行性升高。2．HESC與小鼠骨髓基質細胞共培養(yǎng)或以EB形式誘導分化后，原本在未分化狀態(tài)時不表達的造血一內皮系基因在RT一PCR檢測時逐漸顯示陽性條帶，而未分化基因Oct-4的表達逐漸減弱，中胚層標志基因Brachyury在分化后第6天左右消失。VEGF—R2(Flk-1)在未分化hESC中也有一定程

3、度的表達，隨著分化程度的提高，F(xiàn)lk—l的表達程度也逐漸上升。3．細胞在分化后開始表達CD34這一造血／內皮系共同標記，且在第12天左右達到峰值，同期也獲得了最多的造血集落數(shù)。此后，CD34的陽性率和造血集落的數(shù)量逐漸減弱，但粒一巨噬系集落占所有造血集落的比例卻逐漸上升。4．我們選擇分化后第10天一12天這一CD34表達高峰期為分選時機，以磁珠分選的方法分選hESC來源CD34+細胞，CD34+細胞的純度達到90％以上，這部分細胞同時還

4、表達高水平的CD31、但不表達CD45。將hESC來源CD34+細胞在內皮細胞培養(yǎng)體系中進一步分化成熟，所獲得的貼壁細胞形態(tài)類似于成熟人臍靜脈內皮細胞，具有成熟內皮細胞的特征，表達高水平的CD31、CD34、Flk一1、VE-Cadherin和vWF，能吞噬Dil一AcLDL，在Matrigel基質表面形成網(wǎng)絡狀結構。5．將分化第¨天的EB置于含有VEGF、FGF的膠原基質中，從EB中可以伸展出有內皮細胞積聚的、類似于血管腔樣結構的芽狀

5、分支，為芽生EB。芽生EB問還可形成網(wǎng)絡狀結構，是研究人類胚胎發(fā)育過程中血管生成的一種模型。6．HESC的各個分化階段、hESC來源內皮細胞表面都表達有CXCR4，而且VEGF可以上調細胞表面CXCR4的表達水平。HESC來源內皮細胞可以順SDF一1濃度梯度出現(xiàn)向SDF-1的跨膜遷移，SDF一1可以增強hESC來源內皮細胞的伸展和相互接觸，促進由內皮細胞構成的網(wǎng)絡狀結構的形成。阻斷SDF-1和CXCR4的相互作用可以破壞內皮細胞網(wǎng)絡結構

6、、抑制芽狀結構的生長、切斷芽生EB間的聯(lián)系。 結論：1．在小鼠胚胎成纖維細胞滋養(yǎng)層上，人胚胎干細胞系能夠無限增殖并保持其未分化狀態(tài)。2．在小鼠骨髓基質細胞表面或以懸浮EB形式，未分化hESC能夠進入中胚層途徑，向造ga-內皮系進一步分化。分化后細胞逐漸表達造血／內皮系表面標記，SSEA-4、Oct-4等未分化標志的表達則明顯減弱。3．分化后第12天左右，hESC來源的造血細胞大量涌現(xiàn)，隨著分化程度的加深，細胞有逐步脫離原始胚胎造

7、血階段的可能。4．選擇分化后第10天一12天這一CD34近高峰期為分選時機，可以獲得高純度的hESC來源CD34陽性細胞，而且這部分細胞可以進一步誘導分化為成熟的血管內皮細胞。因此，我們已經建立了一種將hESC定向分化為成熟血管內皮細胞的方法。5．HESC來源內皮細胞表達有SDF—l／CXCR4這一趨化因子配體／受體對，SDF-1／CXCR4可以調節(jié)hESC來源內皮細胞的遷移能力。VEGF可能通過上調細胞表面CXCR4的表達而促進芽生E