人胚胎干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化及后者遷移機(jī)制的研究.pdf

1、本研究的目的是探討人胚胎干細(xì)胞(hESC)向造血～內(nèi)皮系誘導(dǎo)分化的能力，將hESC定向分化為高純度的hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞，為hESC應(yīng)用于構(gòu)建組織工程血管提供依據(jù)。以hESC作為研究載體，建立模仿人胚胎發(fā)育過(guò)程中血管生成的芽生EB模型，探究SDF—l／CXCR4軸對(duì)人類胚胎干細(xì)胞來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和血管生成的影響。 結(jié)果：1．未分化hESC集落表現(xiàn)為圓形或橢圓形、平坦、細(xì)胞排列緊密的細(xì)胞團(tuán)，表達(dá)SSEA-4、TRA-1-60、T

2、RA-1-81等未分化hESC的特異性標(biāo)志，但不表達(dá)SSEA一1。隨著細(xì)胞分化程度的提高，SSEA-4的表達(dá)逐漸減弱，而SSEA-1的表達(dá)進(jìn)行性升高。2．HESC與小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或以EB形式誘導(dǎo)分化后，原本在未分化狀態(tài)時(shí)不表達(dá)的造血一內(nèi)皮系基因在RT一PCR檢測(cè)時(shí)逐漸顯示陽(yáng)性條帶，而未分化基因Oct-4的表達(dá)逐漸減弱，中胚層標(biāo)志基因Brachyury在分化后第6天左右消失。VEGF—R2(Flk-1)在未分化hESC中也有一定程

3、度的表達(dá)，隨著分化程度的提高，F(xiàn)lk—l的表達(dá)程度也逐漸上升。3．細(xì)胞在分化后開(kāi)始表達(dá)CD34這一造血／內(nèi)皮系共同標(biāo)記，且在第12天左右達(dá)到峰值，同期也獲得了最多的造血集落數(shù)。此后，CD34的陽(yáng)性率和造血集落的數(shù)量逐漸減弱，但粒一巨噬系集落占所有造血集落的比例卻逐漸上升。4．我們選擇分化后第10天一12天這一CD34表達(dá)高峰期為分選時(shí)機(jī)，以磁珠分選的方法分選hESC來(lái)源CD34+細(xì)胞，CD34+細(xì)胞的純度達(dá)到90％以上，這部分細(xì)胞同時(shí)還

4、表達(dá)高水平的CD31、但不表達(dá)CD45。將hESC來(lái)源CD34+細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)體系中進(jìn)一步分化成熟，所獲得的貼壁細(xì)胞形態(tài)類似于成熟人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，具有成熟內(nèi)皮細(xì)胞的特征，表達(dá)高水平的CD31、CD34、Flk一1、VE-Cadherin和vWF，能吞噬Dil一AcLDL，在Matrigel基質(zhì)表面形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。5．將分化第¨天的EB置于含有VEGF、FGF的膠原基質(zhì)中，從EB中可以伸展出有內(nèi)皮細(xì)胞積聚的、類似于血管腔樣結(jié)構(gòu)的芽狀

5、分支，為芽生EB。芽生EB問(wèn)還可形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，是研究人類胚胎發(fā)育過(guò)程中血管生成的一種模型。6．HESC的各個(gè)分化階段、hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞表面都表達(dá)有CXCR4，而且VEGF可以上調(diào)細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)水平。HESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞可以順SDF一1濃度梯度出現(xiàn)向SDF-1的跨膜遷移，SDF一1可以增強(qiáng)hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的伸展和相互接觸，促進(jìn)由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成。阻斷SDF-1和CXCR4的相互作用可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)

6、、抑制芽狀結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)、切斷芽生EB間的聯(lián)系。 結(jié)論：1．在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上，人胚胎干細(xì)胞系能夠無(wú)限增殖并保持其未分化狀態(tài)。2．在小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞表面或以懸浮EB形式，未分化hESC能夠進(jìn)入中胚層途徑，向造ga-內(nèi)皮系進(jìn)一步分化。分化后細(xì)胞逐漸表達(dá)造血／內(nèi)皮系表面標(biāo)記，SSEA-4、Oct-4等未分化標(biāo)志的表達(dá)則明顯減弱。3．分化后第12天左右，hESC來(lái)源的造血細(xì)胞大量涌現(xiàn)，隨著分化程度的加深，細(xì)胞有逐步脫離原始胚胎造

7、血階段的可能。4．選擇分化后第10天一12天這一CD34近高峰期為分選時(shí)機(jī)，可以獲得高純度的hESC來(lái)源CD34陽(yáng)性細(xì)胞，而且這部分細(xì)胞可以進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此，我們已經(jīng)建立了一種將hESC定向分化為成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的方法。5．HESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)有SDF—l／CXCR4這一趨化因子配體／受體對(duì)，SDF-1／CXCR4可以調(diào)節(jié)hESC來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。VEGF可能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)而促進(jìn)芽生E