人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞向血管內(nèi)皮細胞定向分化的研究.pdf

1、目的：
　　探討人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞體外誘導分化為血管內(nèi)皮細胞的能力，并對分化后血管內(nèi)皮細胞進行鑒定。
　　方法：
　　1.人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及鑒定:在鼻內(nèi)鏡下夾取正常鼻黏膜組織，采用組織貼壁法培養(yǎng)嗅黏膜間充質(zhì)干細胞;利用流式細胞儀檢測細胞的表面標記物對培養(yǎng)的細胞進行鑒定。
　　2.誘導人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞分化為血管內(nèi)皮細胞:取P3代人嗅黏膜間充質(zhì)干細胞，以1×109/L接種于含2％胎牛血清的L-DMEM

2、培養(yǎng)基的6孔板或培養(yǎng)瓶中，當細胞達到90％融合時，隨機分為2組:誘導組加入含50 ng/ml血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的培養(yǎng)基，對照組不加入血管內(nèi)皮細胞生長因子，分別置37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　3.血管內(nèi)皮細胞的鑒定:
　　(1)倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化。
　　(2)免疫熒光染色:誘導12天后，免疫熒光染色檢測CD31、CD34、vWF在誘導組與對照組細胞中的表達。

3、
　　(3) RT-qPCR:提取誘導組與對照組細胞的RNA，熒光定量檢測Flt-1，vWF，F(xiàn)lk-1在細胞中的表達。
　　(4)細胞表型:利用流式細胞儀檢測血管內(nèi)皮細胞特異性的表面標記物CD31和vWF的表達。
　　(5) NO分泌量的檢測:誘導12天后分別取誘導組與對照組的細胞上清液，按照NO檢測試劑盒的說明書進行操作，測得樣品OD值，代入公式計算NO濃度。
　　(6)體外血管形成實驗:將細胞接種到鋪有Ma

4、trix的培養(yǎng)板中，觀察在基質(zhì)膠上細胞形成毛細血管樣網(wǎng)狀結構的能力。
　　結果：
　　1.培養(yǎng)的細胞貼壁生長，陽性表達CD73、CD90、CD105，陰性表達CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR，符合間充質(zhì)干細胞的鑒定標準，且細胞純度達到95％以上。
　　2.血管內(nèi)皮細胞鑒定:
　　(1)形態(tài)學觀察:誘導后，細胞體積變小，細胞形態(tài)由長梭形逐漸變?yōu)槎趟笮?、形態(tài)逐漸飽滿，立體感增強。
　　(2

5、)免疫熒光:誘導后的細胞CD31、CD34、vWF染色陽性。
　　(3) RT-qPCR:誘導后的細胞中Flt-1，vWF，F(xiàn)lk-1表達明顯增高，具有統(tǒng)計學意義。
　　(4)細胞表型:誘導后的細胞CD31與vWF表達陽性，比例約30％左右。
　　(5) NO分泌量:誘導組培養(yǎng)細胞的上清液中的NO含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義。
　　(6)體外血管形成:誘導組細胞接種于基質(zhì)膠后，形成管樣結構，管樣結構連接成網(wǎng)。