人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、目的：
　　探討人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，并對(duì)分化后血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　1.人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:在鼻內(nèi)鏡下夾取正常鼻黏膜組織，采用組織貼壁法培養(yǎng)嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞;利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)記物對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　2.誘導(dǎo)人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞:取P3代人嗅黏膜間充質(zhì)干細(xì)胞，以1×109/L接種于含2％胎牛血清的L-DMEM

2、培養(yǎng)基的6孔板或培養(yǎng)瓶中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到90％融合時(shí)，隨機(jī)分為2組:誘導(dǎo)組加入含50 ng/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)的培養(yǎng)基，對(duì)照組不加入血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，分別置37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
　　3.血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定:
　　(1)倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)的變化。
　　(2)免疫熒光染色:誘導(dǎo)12天后，免疫熒光染色檢測(cè)CD31、CD34、vWF在誘導(dǎo)組與對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)。

3、
　　(3) RT-qPCR:提取誘導(dǎo)組與對(duì)照組細(xì)胞的RNA，熒光定量檢測(cè)Flt-1，vWF，F(xiàn)lk-1在細(xì)胞中的表達(dá)。
　　(4)細(xì)胞表型:利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的表面標(biāo)記物CD31和vWF的表達(dá)。
　　(5) NO分泌量的檢測(cè):誘導(dǎo)12天后分別取誘導(dǎo)組與對(duì)照組的細(xì)胞上清液，按照NO檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)得樣品OD值，代入公式計(jì)算NO濃度。
　　(6)體外血管形成實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞接種到鋪有Ma

4、trix的培養(yǎng)板中，觀(guān)察在基質(zhì)膠上細(xì)胞形成毛細(xì)血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，陽(yáng)性表達(dá)CD73、CD90、CD105，陰性表達(dá)CD34、CD45、CD11b、CD19和HLA-DR，符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，且細(xì)胞純度達(dá)到95％以上。
　　2.血管內(nèi)皮細(xì)胞鑒定:
　　(1)形態(tài)學(xué)觀(guān)察:誘導(dǎo)后，細(xì)胞體積變小，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變?yōu)槎趟笮?、形態(tài)逐漸飽滿(mǎn)，立體感增強(qiáng)。
　　(2

5、)免疫熒光:誘導(dǎo)后的細(xì)胞CD31、CD34、vWF染色陽(yáng)性。
　　(3) RT-qPCR:誘導(dǎo)后的細(xì)胞中Flt-1，vWF，F(xiàn)lk-1表達(dá)明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(4)細(xì)胞表型:誘導(dǎo)后的細(xì)胞CD31與vWF表達(dá)陽(yáng)性，比例約30％左右。
　　(5) NO分泌量:誘導(dǎo)組培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中的NO含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(6)體外血管形成:誘導(dǎo)組細(xì)胞接種于基質(zhì)膠后，形成管樣結(jié)構(gòu)，管樣結(jié)構(gòu)連接成網(wǎng)。