脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性的機制研究.pdf

1、目的:通過研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增強血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能活性，進一步明確脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進血管生成的生物學(xué)效應(yīng)，進而驗證和了解脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的分子機制，探討AD-MSCs促進HUVECs發(fā)揮功能活性的途徑，為進一步研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及無細(xì)胞治療體系在臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　第一部分細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定①分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪組織來自健康女性吸脂者，經(jīng)組織標(biāo)本所屬人知情。②用誘導(dǎo)液對分離

2、培養(yǎng)的脂肪來源干細(xì)胞進行鑒定。誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞方向分化，分別用油紅O和茜素紅-S檢測其向成脂和成骨分化。③通過流式細(xì)胞儀明確人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CD31陽性細(xì)胞的百分比。
　　第二部分選取第3-6代生長狀態(tài)良好的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，由原來含10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液換成無血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，過夜收集其上清液，離心后加入3％和5％的FBS備用。用含相應(yīng)濃度FBS的DMEM設(shè)立正常對照組，分別進行內(nèi)皮細(xì)胞的增殖實驗、劃痕

3、實驗、Matrigel成管實驗、Matrigel三維培養(yǎng)的出芽實驗。計數(shù)統(tǒng)計表示用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)差表示，
　　第三部分分子機制研究①用雙抗體夾心ELISA法檢測收集上清液VEGF濃度;②在Transwell體系間接共培養(yǎng)，觀察HUVEC在AD-MSCs的誘導(dǎo)下遷移。③用雙抗體夾心ELISA法測定Transwell培養(yǎng)體系中VEGF濃度水平;④分析培養(yǎng)體系中AD-MSCs與HUVECs分泌VEGF的差異性。⑤提取相應(yīng)HUV

4、ECs的總蛋白和總RNA。進行Western blot檢測，測定HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3蛋白的表達;⑥以提取的RNA為模板，轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進一步進行Real-time PCR，檢測HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3的mRNA表達水平。
　　結(jié)果:
　　第一部分.①人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和AD-MSCs在10％FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液流式鑒定培養(yǎng)下生長良好。②培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞

5、免疫組織化學(xué)CD31陽性，定位于細(xì)胞膜。③FCM結(jié)果顯示，CD31陽性細(xì)胞數(shù)占檢測總數(shù)的98.3％，CD34陽性細(xì)胞僅占檢測總數(shù)的0.016％。④脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞即骨細(xì)胞，油紅O和茜素紅S檢測陽性。
　　第二部分①CCK-8細(xì)胞增殖活力檢測用MSC-CM處理的HUVECs24小時與對照組P值＜0.01，兩者具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。培養(yǎng)36小時后，P值＜0.05，兩者有統(tǒng)計學(xué)意義。②劃痕實驗MSC-CM組在前六小時

6、的遷移速率就高于Control組。至12小時，MSC-CM組細(xì)胞侵入面積已達42％，而對照組僅為10％左右。③管腔形成實驗中，實驗組節(jié)點數(shù)平均為21個/視野，而對照組為12個/視野，成組T檢驗得知P＜0.001，具有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。④出芽實驗亦顯示，實驗組與Control組P=0.004，兩者具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第三部分①脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清的VEGF濃度與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清中VEGF的濃度兩者具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義

7、(P＜0.01)。②Transwell遷移實驗AD-MSCs誘導(dǎo)組與對照組兩者具有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。③來自AD-MSCs組的上清液中VEGF濃度為26.87±2.77pg/mL，而Vehicle組則僅為7.65±1.23pg/mL(表3-6)，兩者有極其顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。④每1×104個細(xì)胞為單位，HUCVEC-CM與MSC-CM之間比較分泌VRGF的量有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01);⑤經(jīng)MS