骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：間充質(zhì)干細(xì)胞與血管內(nèi)皮前體細(xì)胞相互影響的現(xiàn)象研究
　　目的:探討如何從C57BL/6小鼠骨髓中分離、培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)與內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)，并研究對(duì)其進(jìn)行鑒定的方法，同時(shí)探討EPCs與MSCs在非接觸共培養(yǎng)體系里，MSCs對(duì)EPCs增殖的影響。
　　方法：1.利用骨髓差速貼壁法從C57BL/6小鼠骨髓中分離出MSC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第三代MSCs表面分子表達(dá)情況；誘導(dǎo)并檢測(cè)其成骨、成軟骨的分化能力。<

2、br>　　2.同樣利用骨髓差速貼壁法從C57BL/6小鼠骨髓中分離出EPC，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)第三代EPCs表面分子，并對(duì)其體外管腔結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行功能的鑒定。
　　3.取第三代的MSCs和EPCs，按1:1的比例接種入Transwell小室共培養(yǎng)體系中，實(shí)驗(yàn)組為：以下室接種EPCs，上室接種MSCs；對(duì)照組為下室接種EPCs，上室接種不含MSCs的空培養(yǎng)基。采用MTT比色法和BrdU熒光標(biāo)記法檢測(cè)MSCs對(duì)EPCs增殖能力的影響。<

3、br>　　結(jié)果:1.從C57BL/6J鼠骨髓腔中成功的分離了MSCs和EPCs，并對(duì)兩者表面分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)。在分化潛能方面進(jìn)行鑒定：MSCs經(jīng)成脂分化、成軟骨分化、成骨分化鑒定成功；EPCs經(jīng)血管形成實(shí)驗(yàn)（Tube formation）鑒定成功。
　　2. MTT比色法結(jié)果顯示，在24、48、72、96小時(shí)實(shí)驗(yàn)組OD值都明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05)
　　3. BrdU熒光標(biāo)記法結(jié)果顯示與對(duì)照組相比

4、較，實(shí)驗(yàn)組BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例顯著增多( P＜0.05)。
　　結(jié)論:利用骨髓差速貼壁法，可分離、純化及擴(kuò)增到MSCs和EPCs，MSCs與EPCs在非接觸共培養(yǎng)條件下能促進(jìn)EPCs的增殖。
　　第二部分:間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞增殖的機(jī)制研究
　　目的：探討胰島素樣生長(zhǎng)因子1（Insulin-like growth factor-1, IGF-1）及其下游胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（Insulin-like g

5、rowth factor1 receptor，IGF-1R）在間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮前體細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用。
　　方法：
　　1.使用ELISA方法檢測(cè)MSCs與EPCs中IGF-1的表達(dá)情況；
　　2.使用不同濃度的IGF-1分別刺激EPCs，檢測(cè)EPCs的增殖情況。
　　3.使用IGF-1-siRNA干擾MSCs中IGF-1的表達(dá)，使用IGF-1R-siRNA干擾EPCs中IGF-1R的表達(dá)，RT-PCR

6、分別驗(yàn)證IGF-1mRNA和IGF-1RmRNA的表達(dá)量；
　　4. MTT法分別檢測(cè)各組EPC增殖情況。
　　結(jié)果：
　　1. MSCs培養(yǎng)液中的IGF-1的表達(dá)為遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EPCs培養(yǎng)液，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2.不同濃度的IGF-1分別刺激EPCs，結(jié)果顯示：20、50、100和200 ng/mL濃度的IGF-1均能使 EPCs的數(shù)量及吸光度值較對(duì)照組都明顯增加(P<0.05)。100 n

7、g/mL的IGF-1能明顯促進(jìn)EPCs的增殖(P<0.05)。
　　3.使用IGF-1-siRNA干擾MSCs中IGF-1的表達(dá)，使用IGF-1R-siRNA干擾EPCs中 IGF-1R的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè) IGF-1mRNA和 IGF-1RmRNA的表達(dá)量明顯下降(P<0.05)。
　　4. MTT法分別檢測(cè)各組EPC增殖，結(jié)果顯示：IGF-1-siRNA干擾MSCs后，EPCs的增殖明顯受到抑制，與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)

8、學(xué)意義(P<0.05)；IGF-1R-siRNA干擾EPCs后，EPCs的增殖也明顯受到抑制，與對(duì)照組比較仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IGF1的中和抗體也能在MSCs促進(jìn)EPCs增殖的過(guò)程中，起抑制EPCs增殖的作用(P<0.05)。
　　結(jié)論：IGF-1可促進(jìn)EPCs的增殖，可能通與其下游的IGF-1受體作用結(jié)合起作用。
　　第三部分：PI3K/Akt信號(hào)通路在MSCs促進(jìn)EPCs增殖中的作用研究
　　目的：初

9、步探討PI3K/Akt通路在MSCs促進(jìn)EPCs增殖中的作用研究。
　　方法：我們?cè)O(shè)計(jì)三組實(shí)驗(yàn)：1.EPC組2.EPC+IGF-1組3.EPC+IGF-1+LY294002組。使用合成的小分子 LY294002，它是一種蛋白激酶抑制劑，能夠特異性的阻斷三磷酸酰肌醇蛋白激酶（Phosphotidylinsitol-3-Kinase，PI3K）細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路；使用 MTT方法檢測(cè)三組EPCs增殖情況；使用RT-PCR方法檢測(cè)三組IG

10、F-1受體因子mRNA的表達(dá)影響，用Western-blot方法檢測(cè)三組磷酸化Akt蛋白的表達(dá)量。將轉(zhuǎn)染GFP熒光的兩組細(xì)胞：EPCs組和EPCs+ IGF-1R siRNA組，分別移植進(jìn)C57BL/6小鼠體內(nèi)，利用熒光顯微鏡檢測(cè)小鼠股動(dòng)脈損傷模型動(dòng)脈內(nèi)膜壁上 EPC增殖情況。以此淺探IGF-1對(duì)EPCs增殖的影響及其可能機(jī)制。
　　結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，LY294002抑制IGF-1刺激下的EPCs增殖。RT-PCR結(jié)果提示加入