骨髓內(nèi)皮祖細胞和間充質(zhì)干細胞對動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮的修復作用.pdf

1、心血管系統(tǒng)疾病是現(xiàn)代社會嚴重威脅人類健康,引起死亡的主要疾病。動脈粥樣硬化(AS)是心血管疾病的主要病因之一,阻止AS的進展已成為基礎醫(yī)學和臨床醫(yī)學研究的熱點。許多心血管疾病發(fā)生的危險因素,如老年、吸煙、糖尿病、高血壓、高脂血癥等都會造成以內(nèi)皮細胞合成一氧化氮(NO)能力下降,細胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?yōu)橹饕攸c的血管內(nèi)皮功能失調(diào),血管內(nèi)皮功能失調(diào)是AS發(fā)生的第一步。AS治療應包括早期阻止內(nèi)皮功能失調(diào)、內(nèi)皮細胞凋亡、防止AS斑塊進展。如何對損傷

2、的內(nèi)皮進行修復,已成為AS研究的重點內(nèi)容。
　　 研究表明內(nèi)皮祖細胞(EPC)具有修復和替代損傷血管內(nèi)皮細胞的功能。將體外培養(yǎng)的EPC輸入血管受損的大鼠體內(nèi),能促進內(nèi)皮再生；生理條件下,輕微受損的血管內(nèi)皮細胞可以通過鄰近細胞的增殖得到修復,而強烈的氧化應激反應導致的內(nèi)膜損傷則要通過循環(huán)中EPC歸巢到損傷部位來修復。
　　 研究發(fā)現(xiàn),在成體外周組織,包括某些正常及損傷血管壁附近均存在一類具有骨髓間充質(zhì)干細胞特征的細胞,這些

3、細胞可能參與了血管組織更新和損傷后的修復過程。離體研究證實骨髓MSC在一定條件下可分化為ECs,分化后的MSC表達ECs特有標志,如血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(KDR)、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體1(F1k-1)及血管細胞黏附分子(VCAM.1)等；此外間充質(zhì)干細胞可能分泌多種細胞因子,為受損血管的修復和新血管的生成提供了適當?shù)奈h(huán)境。
　　 本研究旨在建立高脂飲食導致的動脈粥樣硬化模型,研究大鼠骨髓來源的EPC和MSC對動脈粥樣

4、硬化的治療作用,比較兩者的治療效果,尋找AS細胞治療的有效方法。
　　 目的：
　　 分離培養(yǎng)大鼠骨髓EPC和MSC,研究其生物學特性。
　　 方法：
　　 1、無菌條件下取大鼠股骨,沖出骨髓細胞,用大鼠淋巴細胞分離液分離出單個核細胞,將其重懸在MSC培養(yǎng)液中培養(yǎng),檢測其生物學特性(流式和免疫組化分析表面標志、生長特性)及多向分化潛能(向脂肪細胞、成骨細胞分化)。
　　 2、分離大鼠骨髓單個核細胞

5、,將其重懸在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。應用免疫細胞化學檢測內(nèi)皮細胞表面標志(vWF、CD31、CD144),通過LYEA-1結(jié)合能力、乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)攝取能力的檢測鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細胞,并研究細胞的生長特性和克隆形成能力。結(jié)果
　　 1、骨髓MSC的生物學特性:第三代貼壁細胞均表達MSC表面標志物CD29,CD90,不表達CD34、CD45造血細胞表面標志和CD31、vWF內(nèi)皮細胞表面標志。第三代MSC接種

6、后第1～2天生長較緩慢,從第3天起細胞開始增殖并進入對數(shù)生長期,細胞迅速增殖。根據(jù)公式DT=t×1g2/(1gNt-1gN0),得出MSC倍增時間49.13±0.7h。
　　 2、培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞在特定的培養(yǎng)條件下具有向脂肪細胞、成骨細胞分化的能力,符合骨髓間充質(zhì)干細胞判斷的金標準。
　　 3、培養(yǎng)的EPC vWF、CD31、CD144表達陽性,具有與UEA-1結(jié)合能力和攝取DiI-AC-LDI的能力。EPC的生長

7、特性為:接種后第1～6d為潛伏期,從第6 d起細胞開始增殖并進入對數(shù)生長期。不同傳代次數(shù)之間的EPC其增值能力存在差異,P2代細胞增殖能力強于P5代,它們的增殖能力在第8天顯示出差異(p<0.05),第10天出現(xiàn)顯著差異(p<0.01),P2和P5EPC的倍增時間分別為:82.70±4.28h和90.88±5.30h。骨髓EPC具有克隆形成能力,并且克隆形成的數(shù)目與再種植細胞數(shù)量之間呈良好的線性關系,接種4000、6000、8000、1

8、0000個細胞可分別形成22.00±3.60、33.67±5.13、42.00±3.00、61.00±4.58個內(nèi)皮細胞集落。
　　 結(jié)論：
　　 從大鼠骨髓單個核細胞成功分離培養(yǎng)獲得MSC和EPC。
　　 目的：
　　 建立SD大鼠動脈硬化模型；觀察大鼠血管內(nèi)皮細胞衰老改變。
　　 方法：
　　 1、SD大鼠28只,隨機分為A、B、C、D4組,每組7只。A組喂食普通飼料,B、C、D組喂食

9、高脂飼料。大鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后測定血脂的變化,HE染色分析主要動脈血管結(jié)構(gòu)的改變。
　　 2、膠原酶灌注方法,分離胸主動脈和腎動脈血管內(nèi)皮細胞,應用免疫細胞化學的方法,鑒定內(nèi)皮細胞；應用細胞化學染色的方法檢測衰老相關的半乳糖甘酶(SA—B—gal)活性。
　　 結(jié)果：
　　 1、SD雄性大鼠高脂飼料喂養(yǎng)12周后,大鼠血液甘油三脂、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇水平明顯升高；高脂血癥大鼠動脈血管出現(xiàn)明顯的粥樣硬化

10、改變。
　　 2、分離培養(yǎng)后的胸主動脈和腎動脈血管內(nèi)皮細胞表達vWF,CD31；高脂飲食后的大鼠血管內(nèi)皮細胞衰老增加,SA—β—gal活性明顯增加。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功建立SD大鼠動脈粥樣硬化模型。
　　 2、高脂血癥引起大鼠動脈結(jié)構(gòu)發(fā)生病理改變,動脈血管內(nèi)皮細胞衰老增加,SA—B—gal活性增加。
　　 目的：
　　 研究大鼠骨髓來源的EPC和MSC對動脈粥樣硬化治療的效果。<

11、br>　　 方法：
　　 1、包裝、純化rAAV2-IRES-GFP,并轉(zhuǎn)染EPC和MSC。
　　 2、將轉(zhuǎn)染了rAAV2-IRES-GFP的EPC和MSC經(jīng)尾靜脈分別移植入高脂飲食大鼠體內(nèi),病理對照組注射生理鹽水。注射后兩個月,檢測血脂水平；HE染色觀察主動脈的組織學改變；冰凍切片熒光顯微鏡下觀察GFP標記的細胞。
　　 3、RT-PCR檢測主動脈壁一氧化氮合酶(eNOS)、細胞間黏附分子1(ICAM-1)及

12、載脂蛋白E(apoE)mRNA的表達。
　　 結(jié)果：
　　 與病理對照組比較,EPC和MSC細胞治療后大鼠血脂水平呈明顯下降趨勢,動脈壁脂質(zhì)沉積減少；主動脈冰凍切片中可以檢測到GFP標記的細胞,細胞排列整齊,襯在血管內(nèi)膜上；動脈璧ICAM-1的mRNA表達水平明顯降低,而apoE及eNOSmRNA的表達水平與正常對照組相比有明顯的增高,三種基因的表達以EPC治療組改變最為顯著,提示EPC對動脈粥樣硬化的修復作用優(yōu)于MSC