血管內(nèi)皮祖細(xì)胞對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性調(diào)控作用的研究.pdf

1、慢性骨疾病如骨質(zhì)疏松、成骨不全等,是最為常見的骨代謝異常疾病,也是導(dǎo)致骨折和骨缺損的主要原因之一,并嚴(yán)重影響到牙齒、牙周組織以及頜骨的健康。骨代謝異常時,可能會打破自體干細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài),從而抑制干細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能,影響骨組織的再生與修復(fù)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因其具有自我更新及多向分化潛能,已成為骨再生的重要種子細(xì)胞,對骨缺損有較好的修復(fù)能力。然而,在慢性骨疾病環(huán)境下,BMSCs會因不良的微環(huán)境和局部營養(yǎng)供給的影響而使其

2、生物學(xué)活性和功能受到抑制,影響骨修復(fù)能力。近年來發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)被證實具有新生血管、促進(jìn)局部營養(yǎng)支持和改善微環(huán)境的功能。因此,我們希望可以利用EPCs來促進(jìn)BMSCs的生物學(xué)活性和功能,以提高BMSCs的骨再生能力。本實驗通過建立Transwell間接共培養(yǎng)體系,來探索EPCs是否具有提高大鼠BMSCs(rBMSCs)生物學(xué)特性的功能,為進(jìn)一步促進(jìn)BMSCs的骨修復(fù)能力奠定理論基礎(chǔ),對開發(fā)治療骨質(zhì)疏松等新的治療策略具有重

3、要意義。
　　研究目的：
　　1.探討間接共培養(yǎng)條件下,EPCs對rBMSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)歸的影響。
　　2.探討間接共培養(yǎng)條件下,EPCs對rBMSCs干性的調(diào)控作用。
　　3.探討間接共培養(yǎng)條件下,EPCs對rBMSCs增殖、凋亡、分化的調(diào)控作用。
　　4.探討EPCs對rBMSCs體內(nèi)骨修復(fù)能力的影響。
　　研究方法：
　　1.利用密度梯度離心法結(jié)合全骨髓貼壁法分離培養(yǎng) rBMSCs,倒置顯微鏡

4、觀察細(xì)胞形態(tài);流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞表面分子的表達(dá);克隆集落形成、MTT法檢測細(xì)胞增殖能力。成骨、成脂誘導(dǎo)檢測細(xì)胞多向分化能力。
　　2.采用密度梯度離心法分離出骨髓中單個核細(xì)胞,利用條件培養(yǎng)基結(jié)合差速貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)和純化 EPCs,通過對原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的連續(xù)性觀察、細(xì)胞分子表型基因的表達(dá)檢測、體外小管形成實驗以及免疫組化和免疫雙熒光染色等方法對EPCs進(jìn)行綜合鑒定。
　　3.建立 EPCs、BMSCs transwell

5、間接共培養(yǎng)體系, RT-PCR、流式細(xì)胞儀以及DiI-acLDL熒光染色檢測BMSCs細(xì)胞的轉(zhuǎn)歸。
　　4.間接共培養(yǎng)后,RT-PCR檢測干性轉(zhuǎn)錄因子在 rBMSCs中的表達(dá)情況,real-time PCR檢測其基因表達(dá)量的變化;EDU熒光標(biāo)記法、CFU-F形成率及流式細(xì)胞儀檢測BMSCs增殖及凋亡情況;ALP染色、酶活性定量檢測以及茜素紅染色觀察BMSCs堿性磷酸酶和鈣化結(jié)節(jié)的形成情況,real-time PCR和Western

6、 blot檢測成骨標(biāo)志性基因的表達(dá)量變化;油紅O染色觀察EPCs對BMSCs成脂分化的影響, real-time PCR和Western blot檢測成脂相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)量變化。
　　5.建立大鼠牙槽骨缺損模型,將經(jīng)EPCs作用過的rBMSCs復(fù)合生物支架材料移植入骨缺損區(qū),通過 CM-Dil熒光標(biāo)記進(jìn)行細(xì)胞體內(nèi)示蹤,對術(shù)后的標(biāo)本組織進(jìn)行大體觀察,MicroCT掃描、新骨骨密度檢測以及組織HE染色來檢測BMSCs的骨再生能力。

7、
　　實驗結(jié)果：
　　1.體外分離培養(yǎng)的rBMSCs多呈長梭形、多角形,可以形成單細(xì)胞克隆集落,細(xì)胞增殖呈典型的―S‖形,表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物,而不表達(dá)造血系細(xì)胞的標(biāo)志物,并具有成骨、成脂分化的能力,證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是BMSCs。
　　2.經(jīng)過條件培養(yǎng)基結(jié)合差速貼壁法培養(yǎng)的單個核細(xì)胞在原代早期呈長梭形,而晚期則轉(zhuǎn)變?yōu)殇伮肥癄?。?xì)胞同時具有造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志物的雙重表達(dá),體外可以形成類似微血管樣的結(jié)構(gòu),并且

8、對單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞特異分子免疫組化及雙熒光染色呈陽性表達(dá),證實所分離培養(yǎng)的單個核細(xì)胞為EPCs。
　　3.與EPCs間接培養(yǎng)后的BMSCs,其細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面分子的表達(dá)與對照組相比,沒有明顯差別。因此,在間接共培養(yǎng)條件下,EPCs并未明顯改變BMSCs的細(xì)胞表型。
　　4.間接共培養(yǎng)后,EPCs可以有效維護(hù) rBMSCs干性轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)量,并增強(qiáng)BMSCs細(xì)胞DNA合成能力和細(xì)胞增殖能力,但對BMSCs的凋亡沒有明

9、顯調(diào)控作用。另外,EPCs的間接刺激可以有效促進(jìn) rBMSCs體外成骨及成脂分化能力。
　　5. EPCs于體外間接作用后,可以增強(qiáng)BMSCs在體內(nèi)的骨修復(fù)能力。
　　結(jié)論：
　　1.間接共培養(yǎng)條件下,EPCs不會改變BMSCs細(xì)胞表型特征。
　　2.間接共培養(yǎng)條件下,EPCs能夠維持BMSCs的細(xì)胞干性,并促進(jìn)其體外增殖及分化能力,但對BMSCs的細(xì)胞凋亡沒有影響。
　　3.經(jīng)EPCs間接刺激后的BMSC