骨髓間充質干細胞對炎癥時血管內(nèi)皮細胞TM表達的影響.pdf

1、目的：
　　1.體外研究觀察炎癥反應中小鼠骨髓間充質干細胞對血管內(nèi)皮細胞TM表達的影響。
　　2.探討骨髓間質干細胞對炎癥早期凝血紊亂的影響。
　　方法：
　　1.體外原代培養(yǎng)小鼠骨髓間充質干細胞，細胞貼壁差速法原代提取培養(yǎng)小鼠主動脈血管內(nèi)皮細胞，肺泡內(nèi)灌洗液原代培養(yǎng)小鼠肺泡內(nèi)巨噬細胞，10％FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，顯微鏡下觀察細胞生長狀況。
　　2.將原代培養(yǎng)的第四代血管內(nèi)皮細胞進行細胞爬片后，對細胞進行Ⅷ

2、因子相關抗原即血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)免疫熒光化學反應，觀察并根據(jù)熒光顯微鏡下血管內(nèi)皮細胞的vWF表達狀況進行細胞鑒定，陽性信號為綠色熒光。
　　3.將第五代小鼠骨髓間質干細胞分為對照組和誘導組，對照組細胞按10％FBS完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，誘導組細胞用配制好的細胞成脂誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)，兩組細胞在相同條件下培養(yǎng)2周后，用油紅染色，顯微鏡下觀察細胞胞質內(nèi)是否有脂滴形成。
　　4.以肺泡巨

3、噬細胞和血管內(nèi)皮細胞體外共培養(yǎng)為基礎，LPS不同濃度0ug/ml，0.01ug/ml，0.1ug/ml，1ug/ml，10ug/ml刺激培養(yǎng)的細胞，不同作用時間0h，3h，6h，12h刺激培養(yǎng)的細胞，觀察TM動態(tài)變化，以選擇LPS的最佳作用濃度和時間。
　　5.以肺泡巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞體外共培養(yǎng)為基礎，以PBS刺激為對照，將細胞分為四組，即BMSCs對照組、空白對照組、BMSCs治療組及脂多糖(lipopolysacchari

4、de，LPS)對照組。BMSCs對照組和BMSCs治療組為三種細胞體外共培養(yǎng)，BMSCs治療組及脂多糖對照組兩組加入LPS刺激，LPS終濃度為1ug/ml。LPS刺激6h后，提取RNA和蛋白質，通過實時熒光定量PCR技術和Western blotting技術檢測各組6h TM的基因和蛋白表達變化，以及蛋白定量檢測與細胞凋亡有關的蛋白BAX和BCL-2變化，BAX/BCL-2的比值變化。
　　結果：
　　1.熒光顯微鏡下觀察血

5、管內(nèi)皮細胞vWF表達并拍照，可見各細胞表面有幾乎布滿綠色熒光，vWF的陽性信號為綠色熒光，可鑒定從主動脈血管提取的原代培養(yǎng)細胞為血管內(nèi)皮細胞。
　　2.顯微鏡下可見對照組小鼠間充質干細胞胞質內(nèi)沒有明顯變化，誘導組小鼠BMSCs胞質內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴并被油紅染色成橙紅色，說明小鼠BMSCs細胞具有可被誘導向脂肪細胞分化的能力。
　　3.用LPS五個不同濃度分別刺激細胞6h后，LPS用量濃度為1ug/ml時，內(nèi)皮細胞TM明顯低

6、于其他濃度(P＜0.001)，以1ug/ml LPS濃度作用細胞0h，3h，6h，12h四個時間點，LPS作用6h時，TM明顯減少，低于其他三組。LPS在濃度為1ug/ml，作用時間6h時，內(nèi)皮細胞TM減少最明顯(P＜0.05)，作為LPS的最佳作用濃度和時間。
　　4.四組血管內(nèi)皮細胞TM mRNA的表達量有所差異，其中BMSCs對照組與空白對照組TM mRNA表達無顯著差異(P＞0.05);與BMSCs對照組、空白對照組比較，

7、LPS對照組血管內(nèi)皮細胞TM的mRNA表達量相對明顯減少(P＜0.05);與LPS對照組相比，BMSCs治療組血管內(nèi)細胞TM的mRNA表達量相對明顯增加(P＜0.01)。
　　5.四組血管內(nèi)皮細胞TM蛋白的表達量也有所差異，與LPS對照組相比，BMSCs治療組血管內(nèi)細胞TM的蛋白表達量明顯增加(P＜0.01);與BMSCs對照組、空白對照組比較，LPS對照組血管內(nèi)皮細胞TM的蛋白表達量相對明顯減少(P＜0.05);而BMSCs對照

8、組與空白對照組TM蛋白表達量無明顯差異(P＞0.05)。
　　6.LPS對照組細胞凋亡基因Bax蛋白表達量明顯高于其他三組(P＜0.05)，并且BMSCs治療組細胞抑制基因Bcl-2蛋白表達量明顯高于其他三組(P＜0.05)，BMSCs治療組BAX/BCL-2比值低于LPS對照組(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.LPS刺激后血管內(nèi)皮細胞TM mRNA和蛋白表達減少，細胞凋亡基因BAX蛋白表達增加。
　　2.