晚期糖基化終末產(chǎn)物和骨髓間充質干細胞對血管內皮細胞VEGF信號通路的影響及其機制探討.pdf

1、目的:以人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)為實驗對象，通過晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)干預以及人骨髓間充質干細胞(human mesenchymal stemcells，hMSCs)與HUVEC共培養(yǎng)，應用Western blot、PCR等方法檢測內皮細胞中血管內皮生長因子（vascular end

2、othelial growth factor，VEGF）及其受體和下游PI3K/AKT/eNOS信號通路的表達變化，探討VEGF信號通路在糖尿病大血管病變血管新生障礙中的病理改變和機制以及間充質干細胞對糖尿病患者血管新生促進作用的影響機制。
　　方法:人臍靜脈內皮細胞、人骨髓間充質干細胞常規(guī)培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期后用于實驗。實驗分三組:AGE組、AGE+MSC共培養(yǎng)組，空白對照組（不加任何刺激因素）。對照組常規(guī)培養(yǎng)HUVEC;

3、 AGE組以400ug/ml濃度的AGE與HUVEC共孵育36小時（已經(jīng)通過預實驗確定AGE最佳干預濃度和干預時間，具體見后。）;AGE+MSC共培養(yǎng)組在400ug/ml AGE環(huán)境下將MSC與HUVEC共培養(yǎng)36小時。36小時后提取各組HUVEC的蛋白和mRNA并留取細胞培養(yǎng)上清液備用。采用Westernblot、PCR方法檢測3組內皮細胞的VEGF、VEGFR-1(Flt-1)、VEGFR-2(KDR/Flk-1)、sFlt-1(s

4、oluble VEGFR-1)、p-AKT、p-eNOS的表達。統(tǒng)計學方法采用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組之間的比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05即認為有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、AGE影響VEGF-A和VEGFR的表達
　　AGE干預后，內皮細胞VEGFA、sFlt-1 mRNA表達（3.747±0.415）與對照組（1.007±0.139）相比升高，差異有

5、統(tǒng)計學意義(P＜0.05);VEGFR-2mRNA表達與對照組相比減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　400ng/ml AGE干預36小時后，內皮細胞VEGFR-1蛋白表達（93.129±4.620）與對照組（557.395±9.383）相比下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);VEGFR-2蛋白表達(63.791±7.98)與對照組（571.995±12.65）相比下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　

6、2、AGE影響PI3K/AKT/eNOS信號通路的表達
　　400ng/ml AGE干預36小時后，內皮細胞p-AKT蛋白表達（86.408±3.255）與對照組（482.325±39.859）相比減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;p-eNOS蛋白表達（187.69±20.732）與對照組(426.96±50.063)相比亦減弱，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、與MSC共培養(yǎng)對內皮細胞VEGFR的表達的影響

7、
　　AGE干預后，內皮細胞sFlt-1 mRNA表達與對照組相比升高，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，sFlt-1 mRNA（2.048±0.245）表達與AGE組相比下降（P＜0.05）;
　　AGE干預后，內皮細胞表面VEGFR-1與正常對照組相比表達下降，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，VEGFR-1（319.43±3.649）蛋白表達與AGE組相比升高(P＜0.05);AGE干預后，內皮細胞表面VEGFR-2與正常對照組相比表達明顯下降，

8、經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，VEGFR-2（202.81±48.879）蛋白表達與AGE組相比升高(P＜0.05)。
　　4、與MSC共培養(yǎng)對內皮細胞PI3K/AKT/eNOS信號通路的表達的影響
　　AGE干預后，p-AKT、p-eNOS與正常對照組相比表達明顯減弱，經(jīng)與MSC共培養(yǎng)后，p-AKT蛋白表達（238.385±30.384）與AGE組相比升高(P＜0.05)，p-eNOS蛋白表達（255.545±9.227）與AGE組