晚期糖基化終產(chǎn)物誘導內(nèi)皮細胞中的自噬.pdf

1、目的：
　　 觀察晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation endproducts AGEs)對人內(nèi)皮細胞中自噬的誘導，并探討自噬在動脈硬化內(nèi)皮細胞損傷中的作用。
　　 方法：
　　 1.收集糖尿病合并動脈粥樣硬化(Atherosclerosis AS)患者手術切除的頸動脈動脈粥樣硬化斑塊，通過HE染色、熒光免疫染色并利用內(nèi)皮細胞特異性標記物vWF，標記血管內(nèi)皮細胞；通過透射電鏡觀察細胞超微結構及自

2、噬的發(fā)生；熒光免疫染色觀察自噬特異標記物MAP1-LC3(microtubule-associated protein light chain3)的表達；觀察人頸動脈粥樣硬化斑塊中內(nèi)皮細胞的分布及自噬泡的形成。
　　 2.運用不同濃度的糖基化-牛血清白蛋白(advanced glycation endproduct-bovineserum albumin AGE-BSA)作用不同時間來處理人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbi

3、licalvein endothelial cells HUVECs)，透射電鏡觀察細胞超微結構；MDC自噬囊泡染色；應用免疫印跡技術檢測自噬特異性標識蛋白LC3-Ⅱ/β-actin及溶酶體相關膜蛋白Lampl的表達，并用熒光免疫標記MAP1-LC3，以此評價AGE-BSA對HUVECs自噬水平的影響。
　　 3.自噬誘導劑雷帕霉素和抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine3-MA)干預后，應用MTT法檢測細胞生存率

4、；酶聯(lián)免疫技術檢測培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase LDH)含量，了解自噬對AGE-BSA造成的HUVECs損傷的影響。
　　 4.通過流式細胞技術檢測培養(yǎng)基上清中活性氧物質(zhì)(reactive oxygenspeciesROS)含量；并用抗氧化劑維生素E(α-tocopherol)干預，以探討氧化應激在AGE-BSA誘導自噬中的作用，進一步探討自噬在AGE-BSA誘導的內(nèi)皮細胞損傷中的作用。

5、　　 結果：
　　 1.通過HE染色及熒光免疫染色，我們發(fā)現(xiàn)，在糖尿病患者頸動脈粥樣硬化斑塊纖維帽、內(nèi)膜結合區(qū)(即動脈粥樣硬化肩部)以及脂質(zhì)壞死區(qū)邊緣有較多的新生血管內(nèi)皮細胞，新生血管內(nèi)皮細胞中MAP1-LC3表達較正常血管內(nèi)皮細胞增加。透射電鏡可觀察到新生血管內(nèi)皮細胞中的大量自噬產(chǎn)生。
　　 2.MDC染色、熒光免疫細胞染色和透射電鏡結果均顯示AGE-BSA處理后可誘導HUVECs發(fā)生自噬；免疫印跡技術結果顯示AGE

6、-BSA可上調(diào)HUVECs LC3-Ⅱ/β-actin、Lampl蛋白表達，且此作用在6 h達到高峰。同時自噬抑制劑3-MA能夠抑制AGE-BSA誘導的HUVECs自噬，而自噬誘導劑雷帕霉素能夠促進HUVECs自噬的發(fā)生。
　　 3.AGE-BSA處理HUVECs6 h，抑制了細胞增殖，自噬抑制劑3-MA能夠明顯促進AGE-BSA對細胞增殖的抑制，而自噬誘導劑雷帕霉素能夠緩解AGE-BSA對細胞增殖的抑制。AGE-BSA處理Hu

7、VECs后，造成LDH漏出率明顯增加，而自噬抑制劑3-MA能進一步增加AGE-BSA誘導的細胞上清LDH的漏出，自噬誘導劑雷帕霉素對AGE-BSA誘導的細胞上清LDH的漏出無影響。
　　 4.AGE-BSA處理能夠增加HUVECs胞內(nèi)活性氧(ROS)水平增加?？寡趸瘎│?tocopherol不僅能夠降低AGE-BSA誘導的胞內(nèi)ROS水平，同時能抑制AGE-BSA誘導的LC3-Ⅱ/β-actin表達上調(diào)。
　　 結論：