胰高血糖素樣肽-1對糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機制.pdf

1、研究背景：
　　 糖尿病發(fā)病率正逐年上升，而血管并發(fā)癥已成為其致殘致死的主要原因。血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是血管功能失調(diào)乃至血管病變的始動原因。糖尿病患者的多種代謝紊亂，是造成血管內(nèi)皮微環(huán)境失衡、誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，甚至凋亡的危險因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡不但削弱了血管的抗炎等多種防御功能，而且破壞抗凝纖溶系統(tǒng)平衡，誘導(dǎo)血栓形成，促使粥樣斑塊形成，由此可引起糖尿病一系列血管并發(fā)癥，如動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)，

2、故抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、保護血管內(nèi)皮對于遏制糖尿病性血管病的發(fā)生發(fā)展具有積極意義。
　　 糖基化終產(chǎn)物(Advancedglycationendproducts，AGEs)是體內(nèi)可還原糖的醛基與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生非酶糖基化反應(yīng)的終末期產(chǎn)物。AGEs沉積于血管壁，從而誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，是導(dǎo)致糖尿病并發(fā)血管病變的關(guān)鍵因素之一。AGEs隨著年齡增長而累積增加，而在糖尿病的高糖狀態(tài)下，其形成加速。糖尿病患者的血清、多種組織中AGEs水平顯

3、著高于正常人群，而且AGEs水平和糖尿病血管并發(fā)癥的嚴(yán)重程度存在相關(guān)性。
　　 AGEs在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中起著十分重要的作用。目前認(rèn)為，AGEs激活氧化應(yīng)激是造成內(nèi)皮細(xì)胞受損的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。長期高血糖狀態(tài)下所形成的大量AGEs在血管壁尤其是AS高發(fā)位點沉積，由AGEs受體(receptorofAGEs，RAGE)介導(dǎo)激活氧化應(yīng)激，誘發(fā)活性氧簇(Reactiveoxygenspecies，ROS)生成增多，活化核轉(zhuǎn)錄因子

4、(NF-κB)、炎癥因子，增加內(nèi)皮細(xì)胞的促凝活性，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、凋亡。體內(nèi)大量AGEs形成后難以通過自身代謝或藥物而被清除，故如何保護AGEs誘發(fā)的糖尿病性血管損傷，已逐漸成為眾多學(xué)者關(guān)注的問題。近年有研究顯示，胰高血糖素樣肽-1（Glucagon-likepeptide-1，GLP-1）可通過下調(diào)RAGE的表達(dá)而抑制AGEs-RAGE軸對內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷。GLP-1還能拮抗AGEs誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞氧化還原失衡、胰島素分泌受抑制

5、等負(fù)面效應(yīng)。
　　 GLP-1是主要由腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞分泌的多肽，作為一種安全、有效的促胰島素分泌劑越來越受到關(guān)注，是治療2型糖尿病(Type2DiabetesMellitus，T2DM)的一種新途徑。GLP-1除了廣為人知的促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖、抑制β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)胰島素分泌等作用外，近年來的研究顯示其在糖尿病血管病變中亦起著重要作用。GLP-1可降低TNF-α誘導(dǎo)的炎癥分子水平，以減少高凝狀態(tài)和炎癥反應(yīng)對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，故有學(xué)

6、者建議將GLP-1長效類似物利拉魯肽(liraglutide)用于T2DM合并AS的早期治療。GLP-1可抑制單核細(xì)胞粘附于人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞，減輕血管炎性損傷，阻止AS的進(jìn)展。此外，GLP-1受體激動劑exendin-4激活PKA-PI3K/Akt-eNOS信號傳導(dǎo)通路而刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，以促進(jìn)血管損傷后的迅速修復(fù)。
　　 GLP-1保護內(nèi)皮細(xì)胞可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)，但其機制目前尚不完全清楚。有研究顯示，GLP-1呈劑量依賴性

7、降低AGEs誘導(dǎo)下人血管內(nèi)皮細(xì)胞的ROS水平。GLP-1還可通過上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)而抑制過氧化氫(H202)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷。在用高同型半胱氨酸(Highhomocysteine，HHcy)建立氧化損傷的模型中，exendin-4通過抑制氧化應(yīng)激而升高血管保護因子NO水平。
　　 除抗氧化作用之外，PI3K/Akt及其下游的分子信號可能也參與了GLP-1保護血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，exendin-4激活PKA、P

8、I3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而促人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖。PI3K/Akt信號通路的活化可作用于其底物促凋亡蛋白Bad，進(jìn)而影響線粒體的凋亡相關(guān)基因Bcl-2/Bax比值。Bcl-2/Bax比值降低，線粒體通透性增加，細(xì)胞色素c(cytochromec，cyto-c)釋放入胞漿，繼續(xù)激活下游的caspase-9，后者再促進(jìn)caspase-3水解，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。ZhouYJ等發(fā)現(xiàn)AGEs通過上調(diào)Bax水平而降低Bcl-2/Bax比值，促

9、進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。在胰島β細(xì)胞、心肌細(xì)胞、膽囊細(xì)胞，GLP-1可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族相關(guān)蛋白活性和/或caspase活性而抑制細(xì)胞凋亡。那么在內(nèi)皮細(xì)胞，GLP-1對AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響是否也和caspase、Bcl-2家族，以及cyto-c有關(guān)呢？
　　 探求GLP-1在胰島之外的血管作用及機制，挖掘潛在的分子靶標(biāo)，對T2DM尤其合并血管病變的T2DM患者來說具有積極意義。本研究以AGE修飾的牛血清白蛋白(AGE-mo

10、difiedBSA，AGE-BSA)誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(humanumbilicalveinendothelialcells，HUVECs)凋亡為研究模型，探討GLP-1干預(yù)對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機制，探求抗氧化損傷在糖尿病血管病變防治中的重要性，以期為拓展GLP-1的臨床價值提供實驗基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 本課題擬在建立AGEs誘導(dǎo)HUVECs凋亡為研究模型的基礎(chǔ)上，通過觀測GLP-1干預(yù)對AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮

11、細(xì)胞凋亡的作用，并檢測其對凋亡相關(guān)分子及PI3K/Akt通路的影響，初步探討GLP-1對AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及分子機制。
　　 內(nèi)容：
　　 課題分以下兩大部分:
　　 第一部分，胰高血糖素樣肽-1對糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響
　　 目的：
　　 建立AGEs誘導(dǎo)HUVECs凋亡的研究模型，觀測GLP-1干預(yù)對AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：
　　 1.

12、體外制備、鑒定糖基化終產(chǎn)物
　　 將牛血清白蛋白(BSA)和D-葡萄糖溶于PBS，避光孵育12周制備AGE-BSA。以熒光分光光度計鑒定AGE-BSA。
　　 2.分離、培養(yǎng)、鑒定HUVECs
　　 取新生兒臍帶，注入(Ⅰ)型膠原酶消化，收集內(nèi)皮細(xì)胞懸液，用M199培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于37℃、5％CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞經(jīng)vWF抗體免疫熒光染色進(jìn)行鑒定。
　　 3.四唑鹽(MTT)比色法測定細(xì)胞的活力<

13、br>　　 實驗分組：
　　 不同工作濃度的AGE-BSA（100、200、400μg/mL）作用內(nèi)皮細(xì)胞48h（本論文的所有BSA、AGEs、GLP-1的濃度除非特別說明，否則均指工作濃度;以濃度或時間代表不同分組，下同）;200μg/mLAGE-BSA分別作用內(nèi)皮細(xì)胞12、24、36、48h;不同濃度GLP-1(10、50、100、150nmol/L)作用內(nèi)皮細(xì)胞48h;200μg/mLAGE-BSA與不同濃度GLP-1(

14、0、10、50、100、150nmol/L)共同作用內(nèi)皮細(xì)胞48h。
　　 將細(xì)胞接種于96孔板中，隨機進(jìn)行實驗分組處理后，每孔加MTT溶液20μL，4h后吸除培養(yǎng)基，加入二甲亞楓(DMSO)，選擇570nm波長測吸光度以判斷細(xì)胞活力。同時，設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，比色時以空白孔調(diào)零。MTT比色法所測的吸光度反映細(xì)胞的損傷情況。
　　 4.分別用Wright's-Giemsa染色及吖啶橙、Hoechst3325

15、8熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 5.流式細(xì)胞儀分析凋亡
　　 實驗分4組，分別為陰性對照組、200μg/mLAGEs、100nmol/LGLP-1組、200μg/mLAGEs+100nmol/LGLP-1組，作用內(nèi)皮細(xì)胞10h。收集實驗各組細(xì)胞，離心后棄上清，加PBS洗二次，吹散沉淀細(xì)胞，加入AnnexinV和碘化丙啶(P(l))避光放置15min，流式細(xì)胞儀上樣檢測，CellQuest軟件分析細(xì)胞早期凋亡率。統(tǒng)計

16、學(xué)處理
　　 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用單向方差分析（One-WayANOVA）檢驗，兩兩比較采用LSD法。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。凋亡率采用析因設(shè)計的方差分析。P＜0.050具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.不同濃度AGEs對細(xì)胞活力的影響
　　 100、200、400μg/mLAGEs作用HUVECs48h后，OD值

17、分別為0.29±0.03，0.13±0.03，0.07±0.02，均顯著低于陰性對照組(400μg/mLBSA)（0.42±0.03）和正常對照組（control）（0.40±0.02）(P=0.000)。AGEs的濃度（100、200、400μg/mL）與HUVECs的OD值存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.931，P=0.000)。
　　 2.比較AGEs不同作用時間對細(xì)胞活力的影響
　　 200μg/mLAGEs作用時

18、間(12h、24h、36h、48h)后的細(xì)胞OD值分別為0.27±0.03，018±0.02，0.16±0.02，0.12±0.03，均顯著低于control組的OD值（0.38±0.02）(vs.control，P=0.000)。AGEs作用時間與細(xì)胞活力間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.956，P=0.000)。
　　 3.不同濃度GLP-1單獨處理48h對HUVECs活力的影響
　　 50、100、150nmol/L

19、GLP-1三組的OD值分別為0.42±0.03、0.50±0.02、0.51±0.04，均顯著高于control組的OD值(0.39±0.02)(vs.control，P=0.000)，但10nmol/LGLP-1組（0.38±0.03）與control組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.907)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，GLP-1濃度（10、50、100、150nmol/L）與細(xì)胞OD值間存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.820，P=0.00

20、1)。
　　 4.研究不同濃度GLP-1(10、50、100、150nmol/L)拮抗200μg/mLAGEs對HUVECs的活力影響
　　 AGEs組的OD值為0.09±0.02，與陰性對照組（0.38±0.01）相比，有顯著差異(P=0.000)。AGEs+GLP-1組在10、50、100、150nmol/LGLP-1四種濃度下的的OD值依次為0.11±0.02、0.14±0.01、0.22±0.03、0.23±0.

21、02，分別與AGEs組相比較，結(jié)果顯示除了AGEs+10nmol/LGLP-1組的OD值與AGEs組相比無顯著差異之外(P=0.932)，50、100、150nmol/LGLP-1三組OD值均顯著高于AGEs組(AGEs組vs.50nmol/LGLP-1+AGEs組，P=0.036;vs.100、150nmol/LGLP-1+AGEs組，P=0.000)。AGEs組、四個不同濃度的AGEs+GLP-1組的OD值均顯著低于對照組(P=0.

22、000)。Spearman相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，GLP-1濃度（10、50、100、150nmol/L）與HUVECs的OD值間存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.885，P=0.000)。
　　 5.細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　 各組經(jīng)藥物干預(yù)48h后，Wrihgt’s-Gimesa染色結(jié)果顯示，陰性對照組與GLP-1組的HUVECs細(xì)胞無顯著差異，細(xì)胞核呈均勻淡染;AGEs組細(xì)胞質(zhì)固縮，細(xì)胞核皺縮、致密濃染;AGEs+GLP-1聯(lián)合處理組細(xì)

23、胞核濃染、固縮的細(xì)胞較AGEs組明顯減少。吖啶橙和Hoechst33258染色后熒光顯微鏡下觀察:陰性對照組HUVECs染色質(zhì)呈均勻熒光;AGEs組的細(xì)胞質(zhì)固縮，核致密濃染或裂解呈顆粒狀，核染色質(zhì)邊集;AGEs+GLP-1聯(lián)合處理組核濃染、固縮及核碎裂的細(xì)胞較AGEs組明顯減少。
　　 6.Hoechst33258染色計數(shù)法檢測凋亡率
　　 各組細(xì)胞經(jīng)藥物作用48h后，AGEs組的凋亡細(xì)胞百分率為（22.07±2.20）

24、％，顯著高于陰性對照組(7.23±1.00)％(P=0.000)，同時亦顯著高于AGEs+GLP-1組(16.33±1.23)％(P=0.001)。GLP-1組與陰性對照組相比無顯著差異(P=0.112)。
　　 7.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞早期凋亡率
　　 各組細(xì)胞經(jīng)藥物作用10h后，AGEs組的早期凋亡細(xì)胞百分率為(20.56±1.16)％，顯著高于陰性對照組(7.07±0.65)％(P=0.000)，同時亦顯著高于AGE

25、s+GLP-1組(13.28±1.19)％(P=0.001)。GLP-1組的凋亡率為(4.92±0.39)％，顯著低于陰性對照組(P=0.020)。
　　 結(jié)論：
　　 AGEs呈劑量、時間依賴性誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。一定濃度范圍(50～150nmol/L)GLP-1單獨處理血管內(nèi)皮細(xì)胞時，隨作用濃度增加，細(xì)胞活力增加。首次發(fā)現(xiàn)GLP-1在一定的濃度范圍（50～150nmol/L）內(nèi)有拮抗AGEs抑制HUVECs活力的作

26、用，而且可減少AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　 第二部分，GLP-1抑制糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機制
　　 第一節(jié)，GLP-1對AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激和caspase家族主要酶的影響
　　 目的：
　　 通過激光共聚焦檢測細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并采用酶聯(lián)反應(yīng)法測定caspase-9、-3活性，探討GLP-1在內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡作用的機制。
　　 方法：
　　 1.激光共聚焦檢測

27、活性氧(ROS)
　　 2.ELISA法檢測細(xì)胞凋亡蛋白酶caspase-9、-3活性
　　 各組細(xì)胞孵育48h，消化、離心后、用細(xì)胞裂解液重懸，再加入對應(yīng)的反應(yīng)底物。37℃水浴2h后，加樣至96孔培養(yǎng)板，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測OD值，檢測波長為405nm。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理：
　　 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用單向方差分析（One-WayANO

28、VA）檢驗，兩兩比較采用LSD法。此部分的結(jié)果均采用析因設(shè)計的方差分析。P＜0.050具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.GLP-1抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成
　　 HUVECs陰性對照組的熒光值為30.58±2.20。AGEs作用48h后細(xì)胞的熒光值為60.83±2.14，顯著高于對照組(P=0.000)。AGEs+GLP-1組的熒光值為36.70±1.17，顯著低于AGEs組(P=0.000)，

29、仍高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。析因方差分析顯示，AGEs與GLP-1兩種干預(yù)之間有交互作用(F=51.174，P=0.000)。
　　 2.GLP-1對AGEs誘導(dǎo)caspase-9、-3的活性的影響
　　 各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)48h后，AGEs組的caspase-9、-3顯著高于各自的對照組(P=0.000，0.000)和AGEs+GLP-1組(P=0.036，0.006)，而GLP-1可部分減輕AGE

30、s誘導(dǎo)caspase-9、-3活性的增加。析因方差分析顯示，AGEs與GLP-1兩種干預(yù)之間有交互作用(F=68.549，P=0.000;F=42.132，P=0.000)。
　　 結(jié)論：
　　 AGEs作用于內(nèi)皮細(xì)胞48h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，凋亡蛋白酶caspase-9、-3的活性增加，GLP-1可部分減少AGEs誘導(dǎo)的這些效應(yīng)。因此推測氧化應(yīng)激、caspase-9、-3可能參與了GLP-1拮抗AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞凋

31、亡的作用。
　　 第二節(jié)，GLP-1對AGEs誘導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路的影響
　　 目的：
　　 研究GLP-1對PI3K/Akt信號通路及其下游Bcl-2、Bax、cyto-c蛋白表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步探討GLP-1減輕AGEs所致細(xì)胞凋亡的分子機制。
　　 方法：
　　 1.MTT比色法測定細(xì)胞活力（同第一章）
　　 2.AnnexinV-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡（同第

32、一章）
　　 3.Westernblotting法檢測細(xì)胞p-Akt、Bcl-2、Bax、cyto-c蛋白的表達(dá)
　　 收集各組細(xì)胞，根據(jù)蛋白提取試劑盒操作，分別提取各組細(xì)胞總蛋白及核蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。每組蛋白質(zhì)樣本20μg，以12％SDS-PAGE進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后5％脫脂奶粉封閉2h，洗膜后加入BSA-TBS稀釋的抗磷酸化Akt(Ser473)多克隆抗體(1:2000)、抗Bcl-2單克隆抗體(1:100

33、0)，抗Bax(1:2000)單克隆抗體，抗cyto-c(1:2000)單克隆抗體，4℃孵育過夜，再次洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1:5000)雜交1h，洗膜后ECL超敏發(fā)光液進(jìn)行顯色，結(jié)果用ImageJ分析軟件對目的條帶進(jìn)行灰度值分析。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理：
　　 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，采用單向方差分析(One-WayANOVA)檢驗，兩兩比較采用LSD法

34、。相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法。P＜0.050具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.LY294002對GLP-1拮抗AGEs抑制HUVECs活力的影響
　　 AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞48h的OD值為0.11±0.03，與對照組（0.39±0.03）相比，有顯著差異(P=0.000)。GLP-1與AGEs同時加入，其細(xì)胞OD值為0.22±0.03，顯著高于AGEs組(P=0.001)。LY294002預(yù)處

35、理組的OD值為0.16±0.02，與AGEs+GLP-1組相比顯著降低(P=0.030)。
　　 2.LY294002對GLP-1拮抗AGEs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)作用10h后，AGEs組的早期凋亡細(xì)胞百分率為(20.89±2.67)％，顯著高于對照組（6.07±1.77）％(P=0.000)，同時亦顯著高于AGEs+GLP-1組(11.77±2.50)％(P=0.002)。LY294002預(yù)處理組的凋亡率為(16.6

36、9±2.06)％，顯著高于AGEs+GLP-1組(P=0.045)。
　　 3.LY294002對AGEs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞p-Akt水平的影響200μg/mLAGEs處理48h，細(xì)胞p-Akt水平（0.39±0.04）低于對照組（0.46±0.03），差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.039)。GLP-1和AGEs同孵育的內(nèi)皮細(xì)胞，p-Akt表達(dá)水平（0.51±0.03）明顯升高，為AGEs單獨處理細(xì)胞的1.3倍(P=0.003)。100n

37、mol/LGLP-1單獨處理組的p-Akt表達(dá)（0.64±0.06）顯著高于對照組(P=0.000)。析因方差分析顯示，AGEs與GLP-1兩種干預(yù)之間有交互作用(F=52.244，P=0.000)。PI3K阻斷劑LY294002預(yù)處理可明顯抑制AGEs+GLP-1組升高的p-Akt表達(dá)(P=0.030)。
　　 4.GLP-1對HUVECs的p-Akt水平的影響不同濃度（0、10、50、100nmol/L）GLP-1孵育HUV

38、ECs48h后，p-Akt灰度值分別為0.48±0.05，0.48±0.03，0.56±0.02，0.66±0.04。10nmol/LGLP-1組的p-Akt灰度值與對照組相比無顯著差異(P=0.947)，而50、100nmol/LGLP-1組的p-Akt灰度值均顯著高于對照組(P=0.022，0.000)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，GLP-1濃度(10、50、100nmol/L)與HUVECs的p-Akt灰度值間存在顯著正相關(guān)

39、關(guān)系(r=0.945，P=0.000)。
　　 5.LY294002對GLP-1與AGEs干預(yù)下HUVECs的Bcl-2、Bax、cyto-c蛋白表達(dá)的影響
　　 各組細(xì)胞經(jīng)干預(yù)作用48h后，AGEs組Bax蛋白表達(dá)量顯著高于對照組(P=0.000)，而Bcl-2蛋白表達(dá)與對照組相比無顯著差異(P=0.958)，故Bcl-2/Bax比值顯著低于對照組(P=0.000)。AGEs+GLP-1聯(lián)合處理HUVECs48h后，細(xì)

40、胞的Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于AGEs單獨處理組(P=0.008)，而Bax水平顯著低于AGEs組(P=0.000)，故Bcl-2/Bax比值較AGEs顯著提高(P=0.000)。LY294002的預(yù)處理部分減弱了GLP-1抑制Bax升高的作用(P=0.004vs.AGEs+GLP-1組)，而對Bcl-2水平無顯著影響(vs.AGEs+GLP-1組，P=0.139)，LY294002預(yù)處理組的Bcl-2/Bax比值較AGEs+GLP

41、-1組顯著降低(P=0.000)。
　　 AGEs組cyto-c水平(1.48±0.05)顯著高于對照組(P=0.000)。AGEs+GLP-1聯(lián)合處理HUVECs48h后，細(xì)胞的cyto-c釋放水平(1.01±0.03)明顯低于AGEs單獨處理組(P=0.000)。PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理細(xì)胞1h后，GLP-1減少cyto-c釋放的作用被部分抑制(1.29±0.04)(vs.AGEs+GLP-1組，P=0.000)