胰高血糖素樣肽1對燙傷大鼠早期心肌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景：
　　 細(xì)胞死亡的模式通常包括壞死(Necrosis)和凋亡(Apoptosis)。細(xì)胞凋亡不同于細(xì)胞壞死,它有其獨特的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)改變特點,一般認(rèn)為它是由于外來因素觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)預(yù)存的死亡程序而引發(fā)細(xì)胞的自殺過程。適度的細(xì)胞凋亡是組織器官正常發(fā)育過程中的生理性事件,凋亡過度或者不足則可導(dǎo)致組織器官的器質(zhì)性病變和功能障礙。心肌細(xì)胞通常被認(rèn)為是終末分化細(xì)胞,自誕生后基本喪失分裂、增殖潛能,心肌細(xì)胞過度凋亡可導(dǎo)致心臟有效

2、收縮單位減少,從而對心臟結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生重大影響。心肌細(xì)胞凋亡受眾多因素的影響,如急性心肌缺血缺氧、氧自由基、機械壓力、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載和血管緊張素、醛固酮等神經(jīng)內(nèi)分泌激素以及腫瘤壞死因子-α、白介素-1等細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)在缺血缺氧引起的心肌細(xì)胞損害中,首先出現(xiàn)了大量的細(xì)胞凋亡,而細(xì)胞壞死是隨后發(fā)生的,說明凋亡是傷后早期心肌細(xì)胞死亡的主要形式之一。有研究表明,細(xì)胞過度凋亡也是引起燒傷早期大鼠心肌細(xì)胞損傷和心功能損害的重要原因。因此,如何

3、有效抑制心肌細(xì)胞過度凋亡,是防治燒傷后心肌損害和心功能不全的一個重要措施。
　　 胰高血糖素樣肽1(Glucagon-like peptide1,GLP-1)是主要由遠(yuǎn)端回腸、結(jié)腸和直腸的Langerhans細(xì)胞分泌的一種多肽類腸促胰島素,它主要通過結(jié)合特定的受體-胰高血糖素樣肽1受體(Glucagon-like peptide1 receptor,GLP-1R)產(chǎn)生作用。其主要作用有:葡萄糖依賴性地刺激胰島素分泌；抑制胰高血糖

4、素分泌；抑制胃腸道蠕動和胃液分泌,延遲胃排空；促進胰島β細(xì)胞再生,抑制其凋亡等。GLP-1R除在胰腺組織表達外,還存在于腦、肺、心、腎等臟器。分布的廣泛性決定了它作用的多樣性。Zhao等通過對大鼠離體正常心臟和心臟缺血/再灌注模型進行研究發(fā)現(xiàn),GLP-1除了可以直接作用于心臟,降低左心室等容收縮壓和等容收縮期左心室內(nèi)壓力上升/下降的最大速率；還可通過增加一氧化氮的合成,從而顯著增加心肌葡萄糖的攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1的易位；GLP-1尚可

5、促進缺血30 min后心臟功能的恢復(fù),尤其是使左心室舒張末期壓力得到顯著改善。提示GLP-1具有多方面的心功能保護作用。另有研究證實GLP-1可以直接作用于體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷產(chǎn)生一定的保護作用,其機制可能主要是通過抑制心肌細(xì)胞的凋亡而產(chǎn)生的。
　　 雖然有多項研究表明GLP-1具有抑制細(xì)胞凋亡的作用,但是GLP-1在體內(nèi)很容易被二肽基肽酶-Ⅳ(DipeptidaseⅣ,DPPⅣ)降解,半衰期不足2

6、分鐘,難以進行動態(tài)觀測,從而限制了它在動物實驗中的應(yīng)用。后來人們從美洲希拉毒蜥的唾液中分離得到Exendin-4,它是GLP-1的長效擬似物。初步研究表明Exendin-4與GLP-1作用于同一受體-GLP-1R,產(chǎn)生相似的生物學(xué)效應(yīng),如降血糖、促胰島素分泌、改善胰島功能、抑制胰島β細(xì)胞凋亡等。GLP-1僅有31個氨基酸殘基,而Exendin-4多了8個C端結(jié)合部位的氨基酸殘基,因此Exendin-4與受體的親和力比GLP-1更高。與G

7、LP-1相比,Exendin-4的N端第二個氨基酸為甘氨酸,不會被二肽基肽酶-Ⅳ分解,血漿半衰期更長。Exendin-4能否參與影響燒傷后的心肌細(xì)胞凋亡過程?目前在國內(nèi)外尚未有相關(guān)報道。本研究采用30％TBSAⅢ°燙傷大鼠模型,應(yīng)用GLP-1的長效擬似物Exendin-4進行干預(yù),通過檢測傷后早期心肌組織GLP-1R表達、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及心肌組織半胱天冬酶3(Caspase-3)活性的變化,探討Exendin-4及GLP-1對燒傷早期

8、心肌細(xì)胞凋亡的作用及相關(guān)機制。
　　 研究目的
　　 1.分別了解燙傷早期及Exendin-4干預(yù)后,GLP-1R在大鼠心肌組織中的分布特點和表達變化。
　　 2.觀察燙傷大鼠早期心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)和心肌組織Caspase-3活性的變化規(guī)律。
　　 3.觀察Exendin-4干預(yù)后大鼠的心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及心肌組織Caspase-3活性的改變,試圖闡明Exendin-4對燙傷大鼠早期心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機制

9、。
　　 材料和方法
　　 1.實驗動物與分組:健康成年SD大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)54只,體質(zhì)量(200±20)g,雌雄不拘。隨機分為:正常對照組(N組,n=6)、單純燙傷組(S組,n=24)和燙傷后Exendin-4干預(yù)組(E組,n=24),S和E組又再分為6、12、24和48 h四個時間點,每個時間點6只動物。
　　 2.動物模型的制作:動物稱重后以3％戊巴比妥鈉40 mg/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉

10、。背部剪毛后再以10％硫化鈉脫毛,按公式S=K·W2/3(K=9.0,S單位:cm2,W單位:g)計算出大鼠總體表面積,燒傷面積=總體表面積×30％。將背部脫毛區(qū)浸入100℃水中15 s造成30％TBSAⅢ°燙傷(病理結(jié)果證實),傷后按Parkland公式,即每kg體質(zhì)量每1％燒傷面積4 ml林格平衡鹽液行腹腔注射補液,將總量的一半分為2等份,于傷后即刻和傷后4 h注入,另一半則分為4等份,于傷后8、12、16和24 h注入。傷后第2個

11、24小時,液體量減半,分3次均勻補液。大鼠分籠喂養(yǎng),自由進食。E組給藥方法:將Exendin-4溶解于0.2 mL注射用水,以Exendin-45 ug/kg,2/日,腹部皮下注射,第一次于傷后即刻注入。
　　 3.檢測指標(biāo)及方法:分別于各時間點深度麻醉后處死實驗大鼠,取左心室心尖部心肌組織待測。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測GLP-1R分布特點及表達變化；DNA原位末端缺口標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)測定心肌細(xì)胞凋亡并計算凋亡指數(shù)；

12、免疫熒光分析法檢測心肌組織Caspase-3活性(結(jié)果以反應(yīng)中Caspase-3催化形成的pNA的濃度表示)。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)處理:數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS13.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)處理。本實驗為3×4*6的析因設(shè)計,計量資料行完全隨機分組兩因素析因分析(即two-way analysis of variance),了解各變量之間的主效應(yīng)和交互作用；各時間組、處理組之間行單項分類的方差分析(one-way analy

13、sis of variance);等級資料采用Kruskal-Wallis H檢驗；變量間相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)法。當(dāng)P<0.05時,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.正常對照組、單純燙傷組和Exendin-4干預(yù)組大鼠的心肌組織均存在大量的GLP-1R表達,其主要分布于心肌細(xì)胞的胞膜、胞漿和胞核中。各組實驗大鼠心肌組織GLP-1R的表達量均未見顯著差異。
　　 2.燙傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)

14、于傷后6、12、24、48 h均有顯著升高。相比N組僅見少量的凋亡細(xì)胞表達(0.23±0.32％),S組于傷后6 h心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)即顯著升高(8.13±2.88％),12 h達高峰(14.80±5.46％),此后逐漸下降,傷后24、48 h凋亡指數(shù)(10.27±4.48％,7.07±2.90％)仍顯著高于N組。Exendin-4干預(yù)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)于傷后6、12、24、48 h均有顯著下降。E組在傷后四個時間點的凋亡指數(shù)分別為(

15、4.03±1.18％,6.50±1.41％,3.70±1.05％,2.90±1.11％),與S組相應(yīng)時間點比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.燙傷大鼠心肌組織Caspase-3活性于傷后6、12、24 h均有顯著升高。相比較N組(47.86±16.09 mmol/L),S組心肌組織Caspase-3活性于傷后6 h即顯著升高(104.33±29.92 mmol/L),12 h達最大值(162.87±43.53

16、mmol/L),之后逐漸降低,傷后24 h(111.65±20.43 mmol/L)仍顯著高于正常。E組于傷后6、12、24 h心肌組織Caspase-3活性(65.86±7.80 mmol/L,83.01±16.85 mmol/L,66.82±13.61mmol/L)均顯著低于S組。
　　 4.對S組、E組做Pearson相關(guān)分析,相關(guān)系數(shù)分別為0.674、0.511,P值均小于0.05,心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)與心肌組織Caspas

17、e-3活性之間呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論
　　 1.單純燙傷和Exdendin-4干預(yù)后大鼠的心肌組織均存在大量的GLP-1R表達,其主要分布于心肌細(xì)胞的胞膜、胞漿和胞核。
　　 2.單純燙傷和Exdendin-4干預(yù)后大鼠心肌組織GLP-1R的表達量與正常大鼠比較均未見顯著變化,提示Exdendin-4的抗凋亡作用可能并非通過調(diào)節(jié)GLP-1R的數(shù)量,而是通過結(jié)合、活化GLP-1R,啟動下游分子信號所致。