人胰高血糖素樣肽-1酵母系統(tǒng)異源表達.pdf

1、本文以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為模式生物通過基因工程方法對核糖體蛋白質(zhì)合成起始階段進行人工調(diào)控，研究宿主靶基因上調(diào)表達介導的核糖體循環(huán)加速對異源蛋白表達效率的影響。因此，研究最終目標就是加速核糖體蛋白合成起始速率提升真核細胞異源蛋白表達效率。eIF4B在蛋白合成起始階段對mRNA的招募起到關(guān)鍵作用，是蛋白翻譯的起始因子，通過其編碼基因Tif3的過表達驗證其對人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和紅色熒光

2、蛋白（RFP）組成的融合蛋白GLP-1-RFP表達效率的影響來驗證其提高外源蛋白表達效率的可行性。
　　首先合成含有報告基因Rfp的GLP-1融合蛋白基因Glp-1-rfp；啟動子CUP1和終止子CYC1融合基因Qfh；用限制性內(nèi)切酶EcoRI和HindIII雙酶切質(zhì)粒YEplac112和pMV-QFH，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建質(zhì)粒YEplac112-PCUP1-TCYC1，用限制性內(nèi)切酶PstI和Ba

3、mHI雙酶切質(zhì)粒YEplac112-PCUP1-TCYC1和基因Glp-1-rfp，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，構(gòu)建釀酒酵母表達載體YEplac112-PCUP1-GLP-1-RFP-TCYC1。轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303菌株后，用銅離子誘導基因Glp-1-rfp的表達。在綠色激發(fā)光下觀察釀酒酵母細胞發(fā)出明顯的紅色熒光，證明基因Glp-1-rfp在釀酒酵母W303中成功表達。
　　克隆基因Tif3；啟動子GAL基因，

4、Gal；終止子CYC1基因，Cyc1；用限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI分別雙酶切質(zhì)粒YCplac33和基因Gal，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞篩選陽性克隆子，構(gòu)建質(zhì)粒YCplac33-PGAL；用限制性內(nèi)切酶PstI和BamHI分別雙酶切基因Tif3和質(zhì)粒YCplac33-PGAL，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞篩選陽性克隆子，成功構(gòu)建質(zhì)粒YCplac33-PGAL

5、-TIF3；用限制性內(nèi)切酶SmaI和EcoRI分別雙酶切基因Cyc1和質(zhì)粒YCplac33-PGAL-TIF3，回收酶切產(chǎn)物后用T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞篩選陽性克隆子，成功構(gòu)建釀酒酵母W303表達載體YCplac33-PGAL-TIF3-TCYC1；
　　釀酒酵母表達載體YCplac33-PGAL-TIF3-TCYC1和YEplac112-PCUP1-GLP-1-RFP-TCYC1轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303菌株后，

6、用半乳糖和銅離子分別誘導基因Glp-1-rfp和基因Tif3的表達。在誘導時間相同的情況下，在綠色激發(fā)光下觀察重組釀酒酵母細胞，只轉(zhuǎn)化了基因Rfp的釀酒酵母經(jīng)誘導表達后細胞發(fā)出了明顯的紅色熒光，證明基因Glp-1-rfp在釀酒酵母W303中成功表達；同時轉(zhuǎn)化了基因Glp-1-rfp和基因Tif3的釀酒酵母經(jīng)誘導表達后細胞發(fā)出了熒光強度更高的紅色熒光，證明了基因Tif3和基因Glp-1-rfp同時在釀酒酵母W303中得到表達，且基因Tif