胰高血糖素樣肽-2對原代培養(yǎng)大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的：
　　 胰高血糖素樣肽-2（glucagon-like peptide2，GLP-2）是近年發(fā)現(xiàn)的一種腸上皮特異性的促生長因子。它是胰高血糖素原基因在腸道內(nèi)分泌L細(xì)胞特異表達(dá)翻譯后處理加工的產(chǎn)物。研究認(rèn)為GLP-2能促進(jìn)正常小腸粘膜生長，增強(qiáng)腸道屏障功能，并能促進(jìn)幾種慢性腸病和腸道炎癥引起的腸粘膜損傷的修復(fù)和愈合。因此GLP-2在腸粘膜損傷性疾病中具有臨床應(yīng)用價值。
　　 目前國內(nèi)外關(guān)于GLP-2的研究都集中在整體

2、水平，在整體動物模型中觀察其對腸道的保護(hù)及修復(fù)作用。我們前期研究結(jié)果表明，GLP-2對小腸缺血/再灌注損傷引起的腸屏障降低、對移植小腸功能的恢復(fù)具有積極的作用。在離體細(xì)胞水平的研究由于腸黏膜上皮細(xì)胞分離及計數(shù)的困難而止步不前，因此，GLP-2的作用機(jī)制目前仍不十分清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過分離、制備大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞，利用原代培養(yǎng)的腸黏膜上皮細(xì)胞，在細(xì)胞水平上研究GLP-2的作用，從而為深入探討GLP-2的作用機(jī)制提供重要的細(xì)胞

3、模型。
　　 方法：
　　 本研究選取新生24小時的SD大鼠，取出全段小腸后，首先機(jī)械分離出腸粘膜上皮組織，然后用酶消化的方法分離出腸隱窩細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行培養(yǎng)，6至8天后觀察到鋪路石樣成片細(xì)胞即為腸黏膜上皮細(xì)胞：本實(shí)驗(yàn)以復(fù)孔為單位，每6個復(fù)孔為一組，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果分組進(jìn)行統(tǒng)計。實(shí)驗(yàn)分以下四步進(jìn)行：
　　 一、實(shí)驗(yàn)分為對照組、2nmol/LGLP-2組、20nmol/LGLP-2組、200nmol/LGLP-2組四組，分別在

4、細(xì)胞接種后生長的第4小時、第2天、第4天和第8天觀察各濃度GLP-2對小腸黏膜上皮細(xì)胞的影響。
　　 二、在細(xì)胞培養(yǎng)的第4小時、第2天、第4天、第6天及第8天進(jìn)行四甲基偶氮唑鹽(MTT)檢測，以檢測促增殖效果最顯著的GLP-2劑量及作用時間與效應(yīng)的關(guān)系；選用促增殖效果最顯著的GLP-2劑量檢測其在第2天、第4天及第6天刺激腸上皮細(xì)胞增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的表達(dá)情況，以觀察GLP-2的促進(jìn)細(xì)胞增殖作用。
　　 三、分別

5、在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時期檢測GLP-2受體的分布，以進(jìn)一步研究GLP-2作用機(jī)制。
　　 四、將腸上皮細(xì)胞分為對照組與GLP-2作用組，應(yīng)用過氧化(H2O2)氫損傷，檢測乳酸脫氫酶(LDH)、超氧物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)，以研究GLP-2對小腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷保護(hù)作用。
　　 結(jié)果：
　　 一、小腸黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)
　　 形態(tài)學(xué)觀察顯示，接種的腸隱窩細(xì)胞在培養(yǎng)2-4天后開始伸出偽足，貼壁生

6、長，以單個細(xì)胞分布或呈小簇狀，細(xì)胞為梭形或多角形：6至8天后形成細(xì)胞集落；8至10天后，細(xì)胞匯合成片，可觀察到鋪路石樣的小腸黏膜上皮細(xì)胞；11天后細(xì)胞停止生長。腸粘膜上皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供良好的細(xì)胞模型。
　　 二、GLP-2具有顯著刺激小腸黏膜上皮細(xì)胞增殖的作用
　　 MTT結(jié)果顯示，與空白對照組相比，所有劑量組都具有統(tǒng)計學(xué)意義，20nmol/L組的促增殖作用最強(qiáng)(p＜0.05)，該結(jié)果證實(shí)GLP-2具有顯

7、著刺激小腸黏膜上皮細(xì)胞增殖的作用。PCNA觀察結(jié)果顯示，給藥組第4天開始出現(xiàn)陽性染色；第6天大部分細(xì)胞核陽性染色，促增殖作用最強(qiáng)。
　　 三、GLP-2受體的表達(dá)
　　 通過用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法對GLP-2受體進(jìn)行檢測，分別在細(xì)胞生長的早中晚期的腸粘膜上皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞及小腸內(nèi)分泌細(xì)胞中觀察到GLP-2受體的存在。
　　 四、GLP-2對小腸黏膜細(xì)胞過氧化氫損傷具有保護(hù)作用
　　 在細(xì)胞生長第6天分別在

8、對照組和給藥組加入過氧化氫，并進(jìn)行LDH、SOD、MDA檢測，結(jié)果顯示，與損傷組相比，20nmol/LGLP-2保護(hù)組LDH明顯減少（下降19.36％，P＜0.01）；SOD明顯增高(增高76.67%，P＜0.01);MDA明顯下降（下降28.16%，P＜0.01）。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GLP-2可明顯促進(jìn)原代培養(yǎng)的小腸黏膜上皮細(xì)胞的增殖；其作用方式可能是通過腸黏膜上皮細(xì)胞、腸內(nèi)分泌細(xì)胞及纖維母細(xì)胞上的受