兔氣管黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)的研究.pdf

1、目的：
　　 目前，氣管外傷、腫瘤切除等均可引起氣管缺損，較為理想的治療方法是行一期端端吻合。但當(dāng)氣管缺損長(zhǎng)度超過一定的長(zhǎng)度時(shí)，則無法進(jìn)行無張力吻合，必須植入氣管代替物才能重建其連續(xù)性，維持呼吸道通暢。因此，利用組織工程學(xué)的原理和技術(shù)在體外構(gòu)建出具有氣管主要生理功能的生物活性人工氣管作為移植物修復(fù)氣管缺損成為研究熱點(diǎn)。但是人工氣管置換氣管后管腔內(nèi)上皮細(xì)胞的再生依賴于從宿主氣管鄰近部分上皮細(xì)胞的遷移，通常造成靠近吻合口區(qū)域存在完整

2、的上皮細(xì)胞，而管腔內(nèi)表面的中部沒有成熟的上皮細(xì)胞覆蓋。缺乏發(fā)育良好的上皮細(xì)胞層常常導(dǎo)致管腔狹窄和肉芽增生，影響假體移植后管腔的開放而導(dǎo)致失敗。氣管黏膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)是解決該難題的重要工具之一，本研究擬建立氣管黏膜上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)模型，觀察細(xì)胞在體外生長(zhǎng)及傳代的規(guī)律，為組織工程氣管假體的上皮化提供技術(shù)支持。
　　 方法：
　　 一、分離培養(yǎng)：(1)從4月齡新西蘭大耳兔取出氣管(甲狀軟骨至氣管分叉)，剔除氣管周圍纖維結(jié)締

3、組織，沖洗氣管至蒼白并且無黏液為止。(2)剪開氣管、撕取黏膜，將黏膜置于含有抗生素的PBS液中浸泡除菌。(3)將黏膜剪成約1mm×1mm大小的小塊。(4)將黏膜組織小塊移入培養(yǎng)瓶中，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(5)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞采用刮除法結(jié)合消化排除法純化。
　　 二、細(xì)胞鑒定：對(duì)純化后的細(xì)胞通過SABC法免疫組化鑒定、FITC標(biāo)記的熒光抗體免疫熒光鑒定。
　　 三、傳代與凍存：(1)對(duì)純化的細(xì)胞進(jìn)行傳代研究，并觀察細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)

4、規(guī)律。(2)對(duì)純化后的細(xì)胞進(jìn)行凍存與復(fù)蘇的研究。
　　 結(jié)果：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)：(1)培養(yǎng)約5～6d可見組織塊邊緣少量上皮樣細(xì)胞爬出。此后，組織塊周圍上皮樣細(xì)胞覆蓋面積逐漸增大，細(xì)胞呈現(xiàn)三角形、梭形、圓形、多角形、不規(guī)則形等。高倍鏡下可見部分細(xì)胞頂面伸出纖毛，在培養(yǎng)液中不斷擺動(dòng)。10d后去除組織塊，14～15d時(shí)，細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶壁，有纖毛的細(xì)胞無增殖。(2)通過刮除法結(jié)合消化排除法純化后的細(xì)胞純度較高。
　　

5、 二、細(xì)胞鑒定：(1)SABC法染色檢測(cè)細(xì)胞中角蛋白，胞質(zhì)棕黃色，胞核淡藍(lán)色，結(jié)果表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。(2)FITC標(biāo)記的熒光抗體檢測(cè)細(xì)胞中的角蛋白，胞質(zhì)亮綠色，可見整個(gè)細(xì)胞形態(tài)，表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞為上皮細(xì)胞。
　　 三、傳代與凍存：(1)細(xì)胞可以連續(xù)傳代至第5代，傳代后細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)良好，細(xì)胞隨著代數(shù)的增加細(xì)胞體積逐漸變大。傳代后未見有纖毛的細(xì)胞。第2～4代細(xì)胞貼壁及生長(zhǎng)時(shí)間無明顯差異，第5代細(xì)胞貼壁數(shù)量明顯減少，生

6、長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞體積與前幾代相比明顯變大。(2)本實(shí)驗(yàn)復(fù)蘇凍存3個(gè)月的細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率、貼壁率較高。經(jīng)過本方法凍存與復(fù)蘇的細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，細(xì)胞活性、增殖能力仍然能夠恢復(fù)到凍存前水平。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織塊法成功構(gòu)建出一種較為經(jīng)濟(jì)、便捷、可傳代、可重復(fù)的兔氣管黏膜上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)模型。成功對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定、傳代與凍存的研究，為氣管黏膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)提供了技術(shù)可行性，為組織工程人工氣管的上皮化提供理論