小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及純化鑒定的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　建立一種新生KM小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的可行方法，并對(duì)所得小膠質(zhì)細(xì)胞的純度進(jìn)行鑒定。
　　方法：
　　選用出生24小時(shí)以內(nèi)的KM小鼠。用純物理方法提取大腦皮層原代細(xì)胞后進(jìn)行混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，并輔以營(yíng)養(yǎng)剝離法。原代混合膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)10-14天，待觀察到細(xì)胞充分分層生長(zhǎng)后，以普通濃度胰酶和低濃度胰酶消化分別分離純化小膠質(zhì)細(xì)胞。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)計(jì)算產(chǎn)量，細(xì)胞密度計(jì)算公式:（4個(gè)大格的細(xì)胞個(gè)數(shù)之和/4）×104個(gè)/毫升

2、細(xì)胞懸液。利用Iba1免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法對(duì)其純度進(jìn)行鑒定，陽性細(xì)胞即為小膠質(zhì)細(xì)胞。在隨機(jī)選取的7個(gè)高倍鏡視野下計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞核總數(shù)，并計(jì)算陽性細(xì)胞率，即小膠質(zhì)細(xì)胞純度(％)=陽性染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100％。
　　結(jié)果：
　　原代神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混合培養(yǎng)24小時(shí)后可以觀察到，有少量細(xì)胞貼壁，形態(tài)大多未完全展開。隨后細(xì)胞數(shù)目逐日增多，并出現(xiàn)聚堆生長(zhǎng)，處于底層的星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)開始逐漸鋪開?；旌吓囵B(yǎng)5-7天時(shí)開始明顯分

3、層生長(zhǎng)，混合培養(yǎng)10-14天時(shí)，成堆分層生長(zhǎng)的細(xì)胞連成片，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目越來越多，且大多處于靜息狀態(tài)。分離培養(yǎng)后第7天，小膠質(zhì)細(xì)胞的突起變長(zhǎng)，多級(jí)突起細(xì)胞數(shù)目增加，此時(shí)大部分細(xì)胞轉(zhuǎn)為靜息狀態(tài)。通過單獨(dú)使用營(yíng)養(yǎng)剝離法純化培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞的產(chǎn)量為7.3×105個(gè)/瓶(25cm2)，通過營(yíng)養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法純化培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量為1.0×106個(gè)/瓶(25cm2)。用PBS溶液代替一抗作對(duì)照染色，結(jié)果為陰性。Iba1為小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記

4、物，經(jīng)過Iba1免疫細(xì)胞化學(xué)染色，單獨(dú)使用營(yíng)養(yǎng)剝離法純化培養(yǎng)所得陽性細(xì)胞數(shù)為56.29±3.30個(gè)/視野，細(xì)胞核總數(shù)為79.14±5.05個(gè)/視野，小膠質(zhì)細(xì)胞純度為71.17±2.30％;營(yíng)養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法所得陽性細(xì)胞數(shù)為73.14±9.23個(gè)/視野，細(xì)胞核總數(shù)為76.29±10.03個(gè)/視野，小膠質(zhì)細(xì)胞純度為95.95±1.26％。與單用營(yíng)養(yǎng)剝離法相比，營(yíng)養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法所得陽性細(xì)胞數(shù)和小膠質(zhì)細(xì)胞純度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

5、意義(P＜0.05);所得細(xì)胞核總數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。用營(yíng)養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法進(jìn)行分離純化，成功獲得了純度＞95％的小膠質(zhì)細(xì)胞。
　　結(jié)論：
　　1.本研究采用純物理方法提取原代細(xì)胞，用營(yíng)養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法分離純化所得到的小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量為1.0×106個(gè)/瓶(25cm2)，純度為95.95±1.26％。
　　2.用營(yíng)養(yǎng)剝離法加低濃度胰酶消化法分離純化所得小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)量及純度滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要