LeukameninE對原代培養(yǎng)大鼠腦星形神經(jīng)膠質細胞毒性作用的研究.pdf

1、毒理學是研究化學物質對生物體的毒性反應及其嚴重程度、發(fā)生頻率和毒性作用機制，也是對毒性作用進行定性和定量評價的一門學科。體外細胞實驗等生物技術由于其高通量、高精度、快速以及平行性的特點，已成為生物醫(yī)學研究領域中的一項先進實用的技術，具有很高的應用價值。毒理學的研究必定要深入到細胞及分子水平。中藥（尤其是其復方制劑）成分復雜，應用傳統(tǒng)方法評價中藥的遺傳毒性十分困難，而借助現(xiàn)代細胞學技術，從細胞水平上對藥物在體外進行準確、快速、高效的安全性

2、評價，使得我們能從微觀角度更好地了解中藥遺傳毒性的作用靶點及其作用機制。
　　 星形神經(jīng)膠質細胞（astrocyte，AS），作為神經(jīng)系統(tǒng)中起營養(yǎng)、支持及保護神經(jīng)元作用的一類細胞，由于其敏感性高，更易受到毒性物質的損傷。許多證據(jù)表明，星形神經(jīng)膠質細胞在許多神經(jīng)退行性疾病中有十分重要的作用。迄今為止，有關星形神經(jīng)膠質細胞毒性的研究尚未見到報道。
　　 香茶菜屬植物幾乎遍布我國各地，并且種類繁多，約有30種原植物在民間作藥用

3、，具有清熱解毒、活血化淤、抗菌消炎、抗腫瘤、治療肝炎等各種功效。在藥用香茶菜中，二萜類化合物含量豐富，是其主要的活性成分。其中C-20-未氧化-對映-貝殼杉烯型二萜化合物是生物活性最強的一類，Leukamenin E即為其中的一種。
　　 本論文進行了Wistar 大鼠星形神經(jīng)膠質細胞的純化培養(yǎng)，以對映-貝殼杉烯二萜化合物Leukamenin E為受試藥物，通過SRB檢測、臺盼藍排染、彗星電泳、吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）雙染

4、、細胞形態(tài)的觀察及核染色質形態(tài)觀察等方法，初步研究了該化合物對星形神經(jīng)膠質細胞生長的影響以及其作用機制，以期為Leukamenin E的進一步合理應用提供科學依據(jù)。結果如下：
　　 (1)成功培養(yǎng)了AS并對其進行了純化。實驗通過組織消化、限制性培養(yǎng)以及搖床震蕩等方法，得到了純度高、狀態(tài)良好的AS培養(yǎng)物。原代培養(yǎng)的AS在接種后2-3d完成貼壁，9-12d即可鋪滿培養(yǎng)瓶底。初級培養(yǎng)物含有包括小膠質細胞、成纖維細胞、少量神經(jīng)元在內的多

5、種細胞，通過限制性培養(yǎng)降低這些細胞的含量，而神經(jīng)元逐漸退化，最終死亡；搖床震蕩利用細胞差速貼壁的原理，除去雜細胞，最終得到純度較高的AS培養(yǎng)物。
　　 (2)SRB法及臺盼藍排染法檢測細胞毒性結果顯示，Leukamenin E對AS有很強的細胞毒性，在0.625μM以及1.25μM的低濃度作用下對細胞具有顯著的生長抑制效應，而在5μM以及10μM的高濃度作用時能致細胞死亡。生長抑制效應和致死效應都具有顯著的時間、劑量依賴性。

6、r>　　 (3)倒置顯微鏡形態(tài)觀察及吉姆薩染色顯示，Leukamenin E作用可以引起細胞形態(tài)的顯著改變，并且有明顯的時間、劑量效應。吉姆薩染色實驗中，隨化合物濃度的增加（1.25μM、2.5μM），細胞膜表面微絨毛不清晰甚至消失，細胞核染色質凝集，在高濃度藥物（5μM）作用下，觀察到核碎裂。
　　 (4)彗星電泳實驗結果顯示，化合物Leukamenin E可以引起AS DNA的損傷，并具有時間-劑量效應。隨著化合物作用濃度