晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ERM蛋白和黏附連接蛋白改變及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：本課題以原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical veinendothelial cells，HUVECs)為對(duì)象，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞免疫化學(xué)等方法觀察不同濃度和不同作用時(shí)間的晚期糖基化終產(chǎn)物(Advanced Glycation Endproducts，AGEs)修飾的人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ERM(Ezrin/Radixin/Moesin)蛋白定位及其磷酸化

2、水平的影響，并初步探討其機(jī)制。同時(shí)研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞黏附連接鈣黏著蛋白(VE-cadherin)和細(xì)胞骨架纖維狀肌動(dòng)蛋白(filamcntous actin，F(xiàn)-actin)在AGEs作用下的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及其產(chǎn)生的機(jī)制。通過(guò)上述研究試圖闡明AGEs對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響以及可能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，為進(jìn)一步闡明與AGEs相關(guān)的動(dòng)脈硬化及糖尿病血管并發(fā)癥等多種心血管疾病的發(fā)生機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其防治提供新的思路和有效手段。
　　 研究方法：

3、AGEs修飾的人血清白蛋白(AGE-modified human serum albuminAGE-HSA)，由人血清白蛋白與D-葡萄糖共孵育8周制得。由人臍帶靜脈消化分離而獲得的原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別接種于微孔小皿(petri dish)和六孔板中待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，換無(wú)血清培養(yǎng)基使細(xì)胞獲得同步生長(zhǎng)。用不同濃度的AGEs與HUVECs在體外共同培養(yǎng)不同時(shí)間，并設(shè)立HSA陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。在各實(shí)驗(yàn)組中，分別利用可溶性RAGE的抗

4、體(anti-RAGE IgG)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路(extracellular signal regulated kinase，ERK)上游激酶抑制劑PD98059、p38絲裂原激活的MAPK通路上游激酶抑制劑SB203580、JNK抑制劑SP600125及Rho激酶抑制劑Y27632，預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞：另外，利用重組腺病毒MEK1，MKK6b，p38α，p38β，的無(wú)活性型突變體預(yù)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞24h，繼以AGEs再孵育；或重組腺病

5、毒MEK1，MKK6b的活性突變體單獨(dú)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用間接免疫熒光染色法，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)ERM蛋白和鈣黏著蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位和形態(tài)改變，直接探針羅丹明一鬼筆環(huán)肽(Rhodamine-phalloidin)顯示F-actin形態(tài)改變。另外采用免疫蛋白印跡法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)VE-cadherin表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.隨著AGEs劑量加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)正常時(shí)存在于細(xì)胞周邊的磷酸化的ERM蛋白逐

6、漸向細(xì)胞內(nèi)移位，在胞漿中明顯增多而非磷酸化總ERM細(xì)胞內(nèi)定位則無(wú)明顯改變。AGEs受體的可溶性抗體anti-RAGE可逆轉(zhuǎn)AGEs引起的和ERM蛋白定位和磷酸化狀態(tài)的改變。Rho激酶抑制劑Y27632明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的ERM蛋白定位和磷酸化狀態(tài)改變。ERK抑制劑PD98059及其上游激酶無(wú)活性的重組腺病毒突變體MEK1轉(zhuǎn)染后可以減弱AGEs導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ERM蛋白磷酸化改變。p38MAPK通路抑制劑SB203580及p38 MAP

7、K上游激酶MKK6b及P38α、β的無(wú)活性重組腺病毒突變體轉(zhuǎn)染后可顯著減輕AGEs誘導(dǎo)的ERM蛋白定位及磷酸化狀態(tài)的改變。
　　 2.隨著AGEs劑量加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，VE-cadherin的形態(tài)逐漸發(fā)生改變。正常未受刺激的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)VE-cadherin位于細(xì)胞周邊，邊緣光滑，AGEs作用后呈鋸齒性改變，有些部位缺失斷裂。蛋白印跡Western blotting結(jié)果顯示，AGEs劑量加大和作用時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)VE-cad

8、herin表達(dá)沒(méi)有明顯影響。AGEs受體的可溶性抗體anti-RAGE可逆轉(zhuǎn)AGEs引起的VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變。Rho激酶抑制劑Y27632明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。ERK抑制劑PD98059及其上游激酶無(wú)活性的重組腺病毒突變體MEK1轉(zhuǎn)染后可以減弱AGEs導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin改變。p38MAPK通路抑制劑SB203580及p38 MAPK上游激酶MEK6b及p38α、β的

9、無(wú)活性重組腺病毒突變體轉(zhuǎn)染后可顯著減輕AGEs誘導(dǎo)的VE-cadherin改變。JNK激酶抑制劑SP600125可以顯著減輕AGEs誘導(dǎo)的VE-cadherin改變。
　　 結(jié)論：
　　 1.AGEs以時(shí)間和劑量依賴(lài)的方式引起磷酸化ERM蛋白改變。AGEs與RAGE結(jié)合引起ERM蛋白磷酸化。p38和ERK通路及Rho激酶參與了AGEs誘導(dǎo)的ERM蛋白改變的過(guò)程。
　　 2.AGEs通過(guò)與RAGE結(jié)合后以時(shí)間和劑量