晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子：信號傳導(dǎo)機(jī)制.pdf

1、研究背景心血管疾病是慢性腎功能衰竭(CRF)患者主要的并發(fā)癥之一,也是終末期腎病長期血透患者的主要致死原因.CRF患者心血管并發(fā)癥的發(fā)生率比同齡正常人高10-20倍,且發(fā)病年齡提前,被稱為"加速性血管病變",其發(fā)病機(jī)制目前尚未闡明,但很可能與這類病人的代謝紊亂有關(guān).以往的研究表明,CRF患者循環(huán)中晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)含量增高,在罹患動脈粥樣硬化的CRF病人的動脈血管壁中發(fā)現(xiàn)有AGE沉積,大量的AGE蓄積可能參與了CRF病人血管并發(fā)

2、癥的發(fā)生,因此,AGE被認(rèn)為是一種新的"毒素".方法我們選擇健康成年人外周血中的單核細(xì)胞為靶細(xì)胞,采用如下方法觀察了AGE修飾蛋白對單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1 β、TNF-α的影響.一.單核細(xì)胞分離、處理采用密度梯度離心法分離健康成人志愿者外周血單核細(xì)胞,在10％(v/v)胎牛血清的1640培養(yǎng)液于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),2小時后洗去未貼壁的細(xì)胞,將已貼壁的細(xì)胞消化收集,調(diào)整所需細(xì)胞濃度.二.單核細(xì)胞生成IL-1 β、TNF-α

3、能力測定AGE-HSA與單核細(xì)胞共同作用后,用ELISA法測定上清液中IL-1 β、TNF-α的含量,設(shè)未經(jīng)AGE修飾的HSA為對照組.在阻斷實驗中,單核細(xì)胞分別與不同濃度的抗RAGE IgG、apocynin或SB 203580預(yù)處理1小時后,再與50 μ g/mlAGE-HSA共同培養(yǎng)24小時,按上述方法測定IL-1 β、TNF-α的生成.三.單核細(xì)胞生成活性氧的檢測細(xì)胞處理方式同一、二.加入對O2-·特異的探針7-dihydroi

4、midazo [1,2-a]pyrazine-3-one(MCLA),用化學(xué)發(fā)光法檢測AGE-HSA誘導(dǎo)單核細(xì)胞O2-·的產(chǎn)生量.四.單核細(xì)胞NF-κ B活性檢測(一)免疫細(xì)胞化學(xué)染色法細(xì)胞接種于置有蓋玻片的24孔板中,預(yù)處理方法同二,在AGE-HSA作用下,免疫細(xì)胞化學(xué)染色后,觀察細(xì)胞核內(nèi)NF-κ B的激活移位情況,以及抗RAGE IgG、apocynin或SB 203580預(yù)處理細(xì)胞后NF-κ B的核移位變化.(二)凝膠遷移電泳(E

5、MSA)法將分離的單核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中,預(yù)處理細(xì)胞方法同二,提取細(xì)胞核蛋白、電泳后觀察AGE-HSA及抗RAGEIgG、apocynin或SB 203580作用于細(xì)胞后,胞核NF-κ B的活化情況.五.統(tǒng)計學(xué)方法所有結(jié)果均重復(fù)3次以上,數(shù)據(jù)以x±SD表示.統(tǒng)計由SPSS 10.0軟件完成,采用One-way ANOVA-SNK法比較總體及組間差異.結(jié)論1.與未經(jīng)修飾的HSA相比,AGE-HSA可誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-1 β、TNF-α分泌

6、和活性氧生成及NF-κ B活化.2.抗RAGE IgG和apocynin能抑制AGE-HSA誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-1 β、TNF-α分泌和活性氧生成及NF-κ B活化.3.SB 203580能抑制AGE-HSA誘導(dǎo)單核細(xì)胞IL-1 β、TNF-α分泌和NF-κ B活化,但不影響AGE-HSA誘導(dǎo)的活性氧的生成.總之,AGE通過RAGE介導(dǎo)的途徑刺激單核細(xì)胞生成IL-1 β、TNF-α和活性氧,NADPH氧化酶途徑可能是RAGE細(xì)胞內(nèi)信號途徑