糖基化終產(chǎn)物對成骨細胞Ⅰ型膠原積聚的影響.pdf

1、目的:骨強度降低是骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié),而Ⅰ型膠原(typeⅠ collagen)是骨組織有機基質(zhì)中的主要組分,Ⅰ型膠原的代謝異常嚴重影響骨強度。OP患者骨組織中積聚人量糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end poducts,AGEs),是骨質(zhì)疏松的致病因素之一?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)是參與胞外基質(zhì)降解的主要物質(zhì),其分泌和

2、表達受基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)產(chǎn)物(extracellular matrix metalloproteinaseinducer,EMMPRIN)的調(diào)節(jié)。因此,本試驗旨在觀察AGEs在小鼠成骨細胞株(mouseembryo/fetus calvaria fibroblasts,MC3T3E1)與破骨前體細胞株(mononuclear cells,RAW264.7)共培養(yǎng)體系中對Ⅰ型膠原的合成、降解及在降解過程中發(fā)揮重要作用的MMPs分泌的影響,

3、從而探討AGEs是否通過影響Ⅰ型膠原的合成與降解而改變骨強度,為防治AGEs引起的骨強度降低提供試驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 方法:建立成骨細胞與破骨細胞共培養(yǎng)體系。運用體外制備的不同濃度的AGE-BSA(50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L)、EMMPRlN中和抗體(5mg/L)干預(yù)共培養(yǎng)體系24h。半定量RT-PCR檢測Ⅰ型膠原mRNA水平和單核細胞株破骨細胞表型、功能基因的表達;Westernblot

4、檢測細胞中Ⅰ型膠原蛋白水平;ELISA檢測細胞上清中Ⅰ型膠原水平;測定細胞上清中MMP-2、MMP-9的水平,觀察AGEs對Ⅰ型膠原降解的影響。
　　 結(jié)果:1.單核細胞株RAW264.7能表達成熟破骨細胞的表型標志基因如核因子κB受體活化子、抗酒石酸酸性磷酸酶及骨吸收有關(guān)的功能基因如組織蛋白酶K、整合素αv;2.AGE-BSA促進成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA、蛋白水平表達;也使共培養(yǎng)體系中成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA、蛋白水平顯著增加

5、(P＜0.05),并隨AGE-BSA濃度的增加而遞增(P＜0.05);共培養(yǎng)后成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA、蛋白水平較單獨培養(yǎng)的成骨細胞組增高(P＜0.05)。3.AGE-BSA干預(yù)成骨細胞后,上清中Ⅰ型膠原含量隨AGE-BSA干預(yù)濃度的增加而減少(P＜0.05);共培養(yǎng)體系上清中Ⅰ型膠原的含量也呈劑量依賴方式減少(P＜0.05);共培養(yǎng)組上清中Ⅰ型膠原水平較單獨培養(yǎng)的成骨細胞上清明顯減少(P＜0.05)。4.AGE-BSA呈劑量依賴方式分

6、別促進成骨細胞及破骨前體細胞MMP-2、MMP-9的分泌(P＜0.05);AGE-BSA促進共培養(yǎng)體系中細胞MMP-2、MMP-9的分泌,同樣呈劑量依賴方式增加(P＜0.05);MC3T3E1細胞及RAW264.7細胞上清中MMP-2及MMP-9的水平較共培養(yǎng)體系上清中顯著減少(P＜0.05)。5.加入EMMPRIN中和抗體后上清中MMP-2、MMP-9水平減少,Ⅰ型膠原的含量顯著增加(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:1.單核細胞

7、株RAW264.7具有破骨細胞特征性基因表達譜,是一種較好的破骨前體細胞模型。2.AGEs可增加共培養(yǎng)體系中成骨細胞Ⅰ型膠原基因與蛋白水平的表達,提示AGEs可促進Ⅰ型膠原的合成。3.AGEs促進MMP-2及MMP-9的分泌,并使上清中Ⅰ型膠原的含量減少,加入EMMPRIN中和抗體抑制MMPs分泌后Ⅰ型膠原的含量明顯增加,提示AGEs通過MMPs促進Ⅰ型膠原的降解。4.AGEs增加成骨細胞Ⅰ型膠原的合成,同時促進Ⅰ型膠原的降解,提示AG