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3、植體周圍組織工程化骨。BMSCs進(jìn)入成骨分化后,可以作為種子細(xì)胞應(yīng)用于骨組織工程研究中。I型膠原蛋白是成骨細(xì)胞分泌的,是組成骨組織結(jié)構(gòu)和形成骨力學(xué)強(qiáng)度最基本的基質(zhì)蛋白。本研究采用體外實(shí)驗(yàn),將由兔全血所制備的PRP作用于其自體BMSCs,探討自體PRP在不同的時(shí)間段對(duì)BMSCs增殖及分化能力的影響以及對(duì)成骨細(xì)胞I型膠原蛋白表達(dá)的影響,進(jìn)~步揭示PRP的作用機(jī)制,為臨床根據(jù)生理和病理的需要,對(duì)PRP選擇合理的應(yīng)用時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:@B
4、MSCs的培養(yǎng):應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法取兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(,BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng),具體方法為:將23月齡新西蘭大白兔以戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉,在腿部脛骨平臺(tái)處以16號(hào)骨髓穿刺針垂直骨面,旋轉(zhuǎn)進(jìn)入骨髓腔,抽取46ml骨髓接種于培養(yǎng)瓶,待細(xì)胞達(dá)到7080%貼壁融合后予以傳代,用倒置顯微鏡觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)。②繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:于110d每日將接種于24孔板內(nèi)的第三代BMSCs各取3孔,胰蛋白酶消化后置于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
5、。⑧PRP的制備:采用二次離心法分離兔全血制備PRP,儀器計(jì)數(shù)法獲得全血與PRP中的血小板數(shù)目。具體步驟為:麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后,分離頸動(dòng)脈,抽取全血約lOOml,第一次先以1100r/min速度室溫離心lOmin,吸取全部上清液及紅細(xì)胞液面下12mm液體,再以2200r/min的速度室溫離心lOmin,棄2/3上清液,所剩1/3液體即為PI沖。新鮮獲取的PRP以牛凝血酶激活后,立即加入到細(xì)胞培養(yǎng)系中。④成骨細(xì)胞的鑒定:取第3代生長(zhǎng)良好的BM
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