自體PRP對成骨細(xì)胞骨涎蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:隨著人們生活水平的提高，人們對口腔種植的需求逐漸增加。自從上個世紀(jì)60年代，由Branemark教授等提出種植體-骨界面的“骨結(jié)合”理論，種植技術(shù)和理論研究得到飛快的發(fā)展。目前口腔種植中常見的問題主要為不能形成良好骨結(jié)合和局部骨量不足的問題，為了解決這個問題，很多學(xué)者做了大量的相關(guān)研究。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是組織工程理想的種子細(xì)胞，它可以在體外定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。富血小板血漿(PRP)被刺激后可以釋放大量的生長因子，這些生

2、長因子可以促進骨缺損的修復(fù)和重建。骨涎蛋白(BSP)是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，在成骨細(xì)胞礦化的晚期特異性表達(dá)。本研究體外誘導(dǎo)兔BMSCs分化為成骨細(xì)胞，將兔全血所制備的自體PRP作用于成骨細(xì)胞，探討自體PRP在不同時間段對成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響，進一步揭示PRP的作用機制，為臨床中合理使用PRP提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　?、貰MSCs的培養(yǎng):將3月齡新西蘭大白兔以戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉，以16號骨髓穿刺針抽取脛

3、骨骨髓4-6ml離心后接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞達(dá)到70～80％貼壁融合后進行傳代，用倒置顯微鏡觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)。
　?、诶L制細(xì)胞生長曲線:將生長良好第三代BMSCs配制成1.0×104/ml的BMSCs細(xì)胞懸液，并接種子24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每天取出一組進行計數(shù)，每組設(shè)3復(fù)孔，連續(xù)觀察10天后繪制細(xì)胞的生長曲線。
　?、跴RP的制備:取同一只新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈麻醉，分離頸總動脈并抽取全血，采用二次離心法分離兔全血并制備PR

4、P，并在檢驗室檢測所制備PRP和兔全血血小板數(shù)目。新鮮獲取的PRP以牛凝血酶激活后，立即加入到細(xì)胞培養(yǎng)系中。
　　④實驗分組:實驗組加入含20％PRP的含礦化誘導(dǎo)液的無血清完全DMEM培養(yǎng)液:對照組加入不含PRP的含礦化誘導(dǎo)液的無血清完全DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)3復(fù)孔。
　?、莩晒羌?xì)胞的鑒定:取第3代生長良好的BMSCs用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)后，以堿性磷酸酶染色法及鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色法驗證其具有成骨分化能力。
　　⑥成骨

5、細(xì)胞增殖檢測:應(yīng)用MTT法分別檢測第1、4、7、10d實驗組和對照組中成骨細(xì)胞的增殖情況，其中每組設(shè)定3個復(fù)孔。
　?、叱晒羌?xì)胞堿性磷酸酶活性檢測:應(yīng)用堿性磷酸酶檢測試劑盒分別檢測第4、7、10、14d實驗組和對照組細(xì)胞中堿性磷酸酶的含量，每組設(shè)定3個復(fù)孔。
　?、喑晒羌?xì)胞骨涎蛋白表達(dá)檢測:通過蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)分別檢測第4、9、14、19、24d實驗組和對照組中成骨細(xì)胞骨涎蛋白的表達(dá)情況。
　　

6、結(jié)果:
　?、貰MSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:原代培養(yǎng)5d后，細(xì)胞呈短梭形、梭形、三角形或多角形，多個細(xì)胞聚集成集落，呈散在分布，隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，11-12d左右，可見細(xì)胞鋪滿瓶底的80-90％，貼壁細(xì)胞呈長梭形、紡錘形排列，緊密排列類似集束狀、漩渦狀，傳代后的細(xì)胞增殖速度明顯加快，傳3代以后細(xì)胞形態(tài)較為均一，細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)呈現(xiàn)長梭形或者紡錘體樣，細(xì)胞整體呈魚群樣、漩渦狀或平行排列。細(xì)胞的生長曲線顯示:1-2d

7、為潛伏期，細(xì)胞增殖不明顯，3d后細(xì)胞增殖明顯加快，進入對數(shù)生長期，7d后增殖變慢為平臺期，之后細(xì)胞數(shù)目趨于平緩。
　　②成骨細(xì)胞的鑒定:經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果均呈陽性表達(dá)，表明所培養(yǎng)的BMSCs可以體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，并具有礦化能力。
　?、跴RP的檢測:PRP中的血小板數(shù)目為855±27×109/L，全血中血小板數(shù)目為203±33×109/L，PRP中血小板數(shù)目為全血的4.2倍，符合實驗要求。<

8、br>　?、躆TT檢測增殖結(jié)果:實驗組各時間點均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且在第7d時實驗組獲得最高OD值，對照組各時間點之間無明顯變化。
　　⑤堿性磷酸酶活性檢測:實驗組各時間點均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，且在第10d時實驗組獲得最高OD值，對照組各時間點之間無明顯變化。
　?、轜estern blot檢測骨涎蛋白的表達(dá)水平:實驗組各檢測時間點的灰度值均高于對照組，差異具