氟對成骨細(xì)胞增殖及其MCM3基因表達(dá)的影響.pdf

1、我國是一個地方性氟中毒病情嚴(yán)重的國家，病的類型多，分布廣，病情重，受威脅人口多。隨著相關(guān)研究工作的深入，如果能夠從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)多學(xué)科的角度，利用新的先進(jìn)技術(shù)手段，探索對地方性氟中毒(地氟病)發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，尤其是從分子水平闡明氟中毒發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，將為地氟病的防治提供新的科學(xué)理論或思路。在前期課題的基礎(chǔ)上，我們選擇了氟骨癥相關(guān)基因MCM3(minichromosome maintenance deficient 3(S. Cerevisi

2、ae))進(jìn)行分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究。MCM3是一種與細(xì)胞DNA復(fù)制密切相關(guān)的基因，其在細(xì)胞中含量的多少以及在細(xì)胞內(nèi)分布位置的不同可以反映細(xì)胞的生長狀態(tài)。本課題在驗(yàn)證及改良小鼠成骨細(xì)胞原代培養(yǎng)常用方法的基礎(chǔ)上，測定了成骨細(xì)胞處于不同濃度氟環(huán)境、不同作用時間時氟離子在細(xì)胞內(nèi)的分布情況和濃度變化趨勢；觀察不同劑量氟作用于體外培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞后其增殖情況；檢測氟對成骨細(xì)胞中MCM3蛋白表達(dá)水平的影響及mRNA分布情況；同時檢測氟對成骨細(xì)胞中MCM3

3、mRNA量的影響。 方法：(1)建立與改良小鼠成骨細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，并通過堿性磷酸酶和鈣結(jié)節(jié)染色方法進(jìn)行細(xì)胞來源鑒定。(2)建立核磁共振波譜法檢測成骨細(xì)胞內(nèi)氟離子的方法，觀察染氟后成骨細(xì)胞中氟離子在細(xì)胞內(nèi)的分布趨勢。(3)染氟組按照劑量分為5組，即0、5、10、20、40mg/L組，采用電鏡、繪制生長曲線、MTT法、流式細(xì)胞儀的方法觀察成骨細(xì)胞的增殖情況。(4)免疫組化、原位雜交的方法檢測染氟后成骨細(xì)胞中MCM3蛋白質(zhì)表達(dá)和m

4、RNA的分布。(5)采用Real Time RT-PCR的方法測定染氟后小鼠和人成骨細(xì)胞內(nèi)MCM3mRNA量的變化。 結(jié)果：(1)改良后細(xì)胞培養(yǎng)方法重復(fù)性好、成骨細(xì)胞細(xì)胞生長穩(wěn)定、純化效果好，完全適合建立氟中毒的體外模型。核磁共振波譜法觀察表明：隨著環(huán)境氟離子濃度的升高，進(jìn)入成骨細(xì)胞的氟離子量增加；隨著培養(yǎng)時間的延長，成骨細(xì)胞內(nèi)氟離子量越多；氟離子短期內(nèi)即可進(jìn)入成骨細(xì)胞胞核，且細(xì)胞核中氟離子較易達(dá)到飽和；處于不同濃度氟環(huán)境中，高

5、濃度組20、40mg/L兩組細(xì)胞核氟離子量增加程度明顯于低濃度組。(2)氟對成骨細(xì)胞增殖的影響：染氟10天后，形態(tài)學(xué)上反映5、10、20mg/L組表現(xiàn)出細(xì)胞增殖；染氟48小時后，10mg/L組成骨細(xì)胞數(shù)量增長最快；染氟72小時后，以5mg/L組S期成骨細(xì)胞最多，平均占42.7％；各實(shí)驗(yàn)方法均表現(xiàn)出40mg/L組抑制成骨細(xì)胞的生長。(3)成骨細(xì)胞染氟后，各實(shí)驗(yàn)組及對照組成骨細(xì)胞中MCM3蛋白質(zhì)均有陽性表達(dá)，染氟組表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組，表

6、達(dá)范圍也明顯大于對照組。從表達(dá)的位置看，棕色陽性結(jié)果主要見于細(xì)胞核，且在核中可見局部呈深棕色強(qiáng)陽性表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)，但表達(dá)比較弱。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：各染氟組陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，且均高于對照組。其中以10mg/L組陽性細(xì)胞數(shù)最高，與其他實(shí)驗(yàn)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。(4)MCM3的mRNA相對定量顯示：小鼠和人的各組成骨細(xì)胞中，包括對照組，均有MCM3mRNA存在，但染氟后影響了

7、細(xì)胞中MCM3的mRNA量，小鼠成骨細(xì)胞中以5mg/L組表達(dá)量最高，是對照組的2.54倍，人成骨細(xì)胞中以2.5mg/L組和5mg/L組最高，是對照組的1.21倍，但隨著染氟劑量的增加，MCM3的mRNA量反而減少。氟對人成骨細(xì)胞中MCM3mRNA的相對表達(dá)量整體低于小鼠成骨細(xì)胞中的表達(dá)水平。 結(jié)論：氟在較短時間內(nèi)就可以進(jìn)入成骨細(xì)胞，并到達(dá)細(xì)胞核，成骨細(xì)胞細(xì)胞核可能是氟離子的主要作用部位。氟進(jìn)入細(xì)胞核后，低劑量的氟有促進(jìn)成骨細(xì)胞的

8、增殖作用，而高濃度氟則表現(xiàn)為相對抑制作用。氟作用于成骨細(xì)胞后可以影響MCM3的蛋白質(zhì)表達(dá)、mRNA的分布和量，表現(xiàn)為低劑量促進(jìn)、高劑量相對抑制的雙向作用。提示低劑量氟能夠使成骨細(xì)胞功能活躍、細(xì)胞增殖明顯,可能是由于氟的作用下致使MCM3持續(xù)高表達(dá)，從而成骨細(xì)胞DNA復(fù)制連續(xù)導(dǎo)致其數(shù)量增加、功能活躍，同時也可以判斷，氟的劑量高低對MCM3表達(dá)的影響是不同的，只有低濃度氟進(jìn)入細(xì)胞核后，長期不斷地促進(jìn)MCM3表達(dá)，使DNA復(fù)制異常活躍，從而促