雞TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)成骨細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的：Ca2+在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用，TRPV6是高度的Ca2+選擇性通道，是Ca2+向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的限速步驟。但是，TRPV6在雞體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚，本文旨在研究沉默TRPV6對(duì)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)基因的影響，進(jìn)而闡明TRPV6在雞體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法：根據(jù)已知Genebank TRPV6 mRNA序列和siRNA的設(shè)計(jì)原則，利用美國Ambion公司的在線設(shè)計(jì)軟件，進(jìn)行全基因掃描和分析。篩選3個(gè)可能的RNA干擾靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3個(gè)

2、siRNA序列（與雞的其他基因無同源性）和一個(gè)陰性對(duì)照序列（該序列與任何雞類基因均無同源性）。按照選定的干擾靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的shRNA DNA表達(dá)模板，將shRNA與pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體連接，通過轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，選擇陽性克隆。為探明設(shè)計(jì)的3個(gè)TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒對(duì)成骨細(xì)胞TRPV6基因表達(dá)的抑制效果，提取高純度無內(nèi)毒素TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到雞成骨細(xì)胞，同時(shí)采用Real-time PCR

3、和Western-blot的方法檢測(cè)TRPV6定量表達(dá)變化，篩選出能有效抑制TRPV6表達(dá)的質(zhì)粒。并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到雞成骨細(xì)胞，同樣地采用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測(cè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)基因、OPG和RANKL的定量表達(dá)變化。
　　結(jié)果：酶切和測(cè)序結(jié)果顯示，成功構(gòu)建了雞TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒。在探明TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒對(duì)成骨細(xì)胞TRPV6基因表達(dá)的抑制效果的試驗(yàn)中，Real-timePCR結(jié)果表明，與對(duì)

4、照組比較，在轉(zhuǎn)染48h后質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3可使TRPV6的表達(dá)水平降低45.7％(P＜0.01)，質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-2可使TRPV6的表達(dá)水平降低27.8％(P＜0.05)，而pSIREN-TRPV6-1并未明顯改變TRPV6的表達(dá)(P＞0.05);Western-blot結(jié)果顯示，pSIREN-TRPV6-3可明顯抑制TRPV6的表達(dá)水平(P＜0.01)。將重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3轉(zhuǎn)染到雞成骨細(xì)胞

5、，Real-time PCR結(jié)果顯示，calbindin-D28K的表達(dá)水平降低了27.9％(P＜0.01)，而PMCA1b、NCX1、OPG和RANKL的表達(dá)未發(fā)生改變。Western-blot結(jié)果表明:calbindin-D28K的表達(dá)顯著降低(P＜0.01)，RANKL的表達(dá)未明顯改變。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了雞TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒;在成骨細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，TRPV6只調(diào)節(jié)calbindin-D28K的表達(dá)，而對(duì)NCX1