TRPV6在蛋雞不同組織的表達分布及其在蛋殼腺鈣離子轉運中的作用.pdf

1、TRPV6是瞬時性受體電位通道TRP超家族中的成員.廣泛分布于哺乳動物Ca2+大量轉運組織:腸道、腎臟、胎盤、骨骼等.是專門的上皮樣通道,具有高度的Ca2+選擇性,承擔Ca2+向細胞內轉運的限速通道.但TRPV6在蛋雞上皮細胞Ca2+轉運的重要作用還未曾報道,本文旨在研究TRPV6在蛋雞體內的表達分布及其在蛋殼腺Ca2+轉移中的重要作用,進而闡明產(chǎn)蛋期TRPV6在維持體內鈣離子平衡的作用機制.
　　 試驗Ⅰ鈣離子跨細胞轉運相關蛋

2、白基因在蛋雞不同腸段和腎臟中的表達
　　 10羽220日齡高產(chǎn)蛋雞,斷頸處死,采集不同腸段和腎臟組織.應用RT-PCR方法分別從蛋雞不同腸段和腎臟組織擴增得到雞TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b編碼基因,然后將特異性片段連接到pMD18-T載體,測序分析擴增片段準確性；同時應用Real-time PCR方法檢測不同腸段和腎臟中三種蛋白編碼基因的表達量。結果表明:分別擴增得到426 bp的TRPV6序列,789 bp的C

3、aBP-D28K序列以及644 bp的PMCA1b序列,測序結果與GeneBank報道的預測序列一致.另外,TRPV6 mRNA在十二指腸表達量最高,其次是空腸(P<0.05)、回腸(P<0.01)、盲腸(P<0.01)和直腸(P<0.01),腎臟表達量顯著低于十二指腸(P<0.05)；CaBP-D28K和PMCA1b mRNA在十二指腸、空腸、回腸段表達量較高,直腸和腎臟中表達量顯著降低(P<0.05).結果顯示:在蛋雞腸道和腎臟都存

4、在鈣離子跨細胞轉運相關蛋白基因的表達,并提示蛋雞腸道鈣離子轉移主要在小腸段完成；同時,TRPV6基因的成功擴增為深入研究蛋雞腸道鈣離子轉運機制開辟了廣闊的領域.
　　 試驗Ⅱ TRPV6在蛋雞不同腸段和腎臟中的表達分布
　　 試驗動物同前.為探明TRPV6蛋白在蛋雞腸道和腎臟中的組織學分布特點,采用石蠟切片、特異性的TRPV6抗體對高產(chǎn)蛋雞不同腸段和腎臟組織進行免疫組織化學方法研究,同時采用western-blot方法研

5、究TRPV6蛋白在這些部位的濃度變化.結果表明:在十二指腸、空腸、回腸、盲腸和直腸的刷狀緣絨毛上皮均有TRPV6陽性表達分布,直腸陽性表達較少,腸隱窩或杯狀細胞則偶有表達。在腎臟,TRPV6在近曲小管、遠曲小管和連接小管均有陽性表達。western-blot結果指出十二指腸TRPV6含量最高,直腸含量最低,其他腸段位于二者之間.腎臟TRPV6含量也低于十二指腸.結果顯示:TRPV6蛋白在蛋雞整個腸道和腎臟上皮具有陽性表達,表明鈣離子跨細

6、胞轉運在蛋雞體內腸道鈣離子吸收或腎臟重吸收都具有重要作用.
　　 試驗Ⅲ TRPV6在蛋雞不同生殖器官組織中的表達
　　 試驗動物同前。觀察TRPV6在蛋雞卵巢、輸卵管膨大部、峽部以及子宮的表達分布,本試驗采用RT-PCR和免疫組化技術進行定性研究,同時采用Real-time PCR和western-blot方法觀察其定量表達變化。結果表明:卵巢TRPV6蛋白主要分布在卵泡細胞、顆粒細胞以及卵泡膜細胞；在膨大部、峽部以及

7、子宮主要分布在黏膜上皮的纖毛上皮頂端(面向管腔),在子宮黏膜上皮的基底層細胞也有少量分布；另外,與卵巢組織中TRPV6表達量相比,膨大部和峽部mRNA表達量顯著降低(P<0.05),膨大部TRPV6蛋白含量顯著降低(P<0.05),子宮組織中TRPV6 mRNA水平低于卵巢組織,但蛋白表達量高于后者,且統(tǒng)計學分析沒有顯著差異.結果顯示,TRPV6在卵巢、膨大部、峽部以及子宮位置均有表達,提示TRPV6不僅參與卵泡的發(fā)育、成熟,對蛋白以及

8、蛋殼的形成也具有重要的意義.
　　 試驗Ⅳ產(chǎn)蛋循環(huán)過程中TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b在蛋殼腺的動態(tài)表達
　　 研究鈣離子跨細胞轉運方式在蛋殼形成過程中的作用,本實驗將40羽220日齡ISA蛋雞分為5組,于產(chǎn)蛋后0h、2h、4.5h、8h、16h斷頭處死,采集蛋雞蛋殼腺組織,運用Real-time PCR和 western-blot方法檢測產(chǎn)蛋循環(huán)過程中 TRPV6、CaBP-D28K、PMCA1b mRN

9、A和蛋白濃度的動態(tài)變化.結果表明:卵子未進入蛋殼腺前(產(chǎn)蛋后0～4.5h),蛋殼腺內TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b mRNA表達水平較低,隨后表達量逐漸升高,在蛋殼鈣化過程中達到最大值(產(chǎn)蛋后16 h),與0h相比,TRPV6和CaBP-D28KmRNA表達差異均極顯著(P<0.01)；另外,產(chǎn)蛋循環(huán)過程中,TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b蛋白濃度變化與mRNA變化一致,產(chǎn)蛋后16 h到達最大值,其中CaBP-

10、D28K蛋白濃度與0 h相比,差異顯著(P<0.05).結論:產(chǎn)蛋循環(huán)可調控蛋殼腺內 TRPV6、CaBP-D28K和PMCA1b的表達,并提示鈣離子跨細胞轉運途徑在蛋殼鈣化過程鈣離子進入過程發(fā)揮重要作用。
　　 試驗Ⅴ血漿鈣磷濃度及其相關激素水平在產(chǎn)蛋循環(huán)中的動態(tài)變化
　　 40羽220日齡ISA蛋雞分為5組,詳細記錄產(chǎn)蛋間隔時間,分別于產(chǎn)蛋后0h、2h、4.5 h、8 h、16 h斷頭處死,采集血液,測定血漿總鈣、總

11、磷、甲狀旁腺激素、降鈣素、堿性磷酸酶和骨鈣素水平.結果表明:在產(chǎn)蛋循環(huán)過程,血漿總鈣、總磷濃度未發(fā)生顯著變化；血漿甲狀旁腺激素水平在產(chǎn)蛋后16 h蛋殼鈣化過程中達到最高水平,與產(chǎn)蛋后0h相比,差異顯著(P<0.05)；血漿降鈣素水平在產(chǎn)蛋后0h含量最高,后逐漸降低,在8 h達到最低點(P<0.05)；產(chǎn)蛋后8 h,血漿堿性磷酸酶活性達到最高,與0 h相比,差異顯著(P<0.05)；另外,血漿骨鈣素水平在產(chǎn)蛋后4.5 h到達最高,但差異不