Fos12和Leptin基因的克隆及其在豫南黑豬不同組織內(nèi)表達規(guī)律的研究.pdf

1、Fosl2(Fos-like antigen2)屬于活化因子蛋白1(activator protein-1，AP1)轉(zhuǎn)錄因子家族中的一種，在多種組織中均有顯著表達，對哺乳動物的生長發(fā)育、生殖性狀、免疫應答等方面起到重要的作用。近年來，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)Fosl2基因與脂肪代謝、骨骼發(fā)育以及疾病和癌癥的發(fā)生有著重要聯(lián)系;Leptin基因是人們最早發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)能量代謝的基因。本研究在實驗室前期工作的基礎上，以豫南黑豬為試驗材料，對Fos

2、l2和Leptin進行克隆測序及生物學信息分析，研究了豫南黑豬在不同發(fā)育時期及不同組織中的發(fā)育差異性表達，以期探索Fosl2和Leptin在豬不同發(fā)育階段中所起的作用，從基因角度闡明豫南黑豬的組織表達譜規(guī)律。根據(jù)NCBI中GenBank已經(jīng)公布的人、鼠、牛和大猩猩Fosl2的mRNA序列，利用計算機軟件DNAstar進行基因序列的同源性比對，找出不同物種之間Fosl2基因cDNA的保守區(qū)域后設計特異性引物，采用RT-PCR技術克隆基因，

3、利用克隆的堿基序列作為探針在NCBI中進行同源性比對，利用生物信息學軟件對兩種基因的氨基酸結(jié)構和序列特征進行分析和預測，采用實時熒光定量PCR方法在mRNA水平上檢測兩種基因在豫南黑豬不同生長發(fā)育時期中的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉和背部脂肪組織中的表達變化和表達差異情況。通過上述方法得出如下試驗結(jié)果:
　　1、根據(jù)不同物種比對后得到的保守區(qū)域，設計特異性引物，采用RT-PCR方法從豫南黑豬胎衣中擴增出Fosl2基因部分cD

4、NA序列，從背部脂肪組織中擴增出Leptin基因部分cDNA序列，分別為1427 bp和253bp;其中Fosl2的CDS區(qū)域長度為984 bp。
　　2、根據(jù)1中所示方法在豫南黑豬的內(nèi)臟器官中擴增該基因序列時，得到長度為770bp的Fosl2轉(zhuǎn)錄本。與胎衣中所得片段相比，該轉(zhuǎn)錄本第三外顯子后端缺失44個堿基序列，在第四外顯子的前端同樣有堿基缺失，長度為614 bp。
　　3、利用生物學信息軟件分析豫南黑豬Fosl2基因所得

5、序列與Leptin基因的CDS與多種物種的同源一致性，結(jié)果顯示:豬Fosl2基因序列與牛(NM_001192950.1)、人(BC022791.1)、獼猴(NM_001260911.1)、大猩猩(XM_004029036.1)、鼠(XM_004686333.1)、樹鼩(XM_006162129.1)、馬(XM_005600106.1)的核苷酸同源性分別為91％、89％、89％、89％、89％、88％、90％。而與上述物種的氨基酸一致性則

6、分別為:85％、86％、84％、85％、82％、83％、71％?？梢娫摶蛟诓煌锓N之間的保守性較高。Leptin基因與人(NM_000230.2)、牛(NM_173928.2)、鼠(NM_013076.3)、海豹(AJ618981.1)、海獅(AM157372.2)、犬(NM_001003070.1)、灰海豹(AJ618982.1)、小家鼠(NM_008493.3)、獼猴（NM_001042755.1）、家貓(NM_001009850

7、.1)等物種核苷酸同源性分別為88％、92％、85％、83％、87％、92％、83％、85％、88％、91％，而與上述物種的氨基酸一致性分別為97％、100％、94％、89％、87％、90％、92％、94％、97％、92％，該基因在哺乳動物間的保守型同樣較高。
　　4、通過實時熒光定量PCR技術檢測到豫南黑豬Fosl2基因在多種組織內(nèi)廣泛表達，其中在7日齡、30日齡、60日齡和180日齡中肺臟組織中的相對表達含量雖有較大波動，但一

8、直維持在最高的相對表達水平，其次是在脾臟組織內(nèi)的相對表達含量。而Leptin基因在180日齡中的脂肪組織內(nèi)相對表達含量最高。
　　5、兩種基因在同一組織的不同發(fā)育時期的變化規(guī)律為:肺臟組織中Fosl2基因的mRNA變化幅度最大，7日齡肺臟、腎臟和脾臟內(nèi)的相對表達含量為各個時期的最高值，30日齡的肌肉組織內(nèi)相對表達含量最高，180日齡時心臟和背部脂肪內(nèi)Fosl2基因的相對表達含量最高。Leptin基因在7日齡腎臟和肌肉內(nèi)的相對表達量