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文檔簡介
1、自1998年“雞Leptin基因”被首次報道以來,雞Leptin基因序列的正確性,甚至Leptin是否在家禽中存在就一直備受爭議。雖然家禽中Leptin受體(LEPR)的存在被廣泛證實,但對其功能的研究卻由于內(nèi)源性Leptin的缺乏而受到限制。直到2014年,野生鳥類Leptin基因的成功克隆,部分回答了禽類中是否存在Leptin基因這一長久困擾禽類Leptin/LEPR研究的問題,克服了禽類Leptin/LEPR研究的瓶頸。自此,Le
2、ptin/LEPR在禽類尤其是家禽中的克隆和功能研究成為目前研究的熱點。本研究在公開數(shù)據(jù)庫序列搜索和分析的基礎(chǔ)上,首先對鵪鶉Leptin及其受體LEPR基因進(jìn)行克隆和結(jié)構(gòu)分析,并采用實時熒光定量PCR的方法對其組織表達(dá)模式進(jìn)行研究;以3周齡(未開產(chǎn))和20周齡(高產(chǎn)期)的朝鮮龍城黃羽母鵪鶉為研究對象,對其性腺軸上的繁殖相關(guān)基因及Leptin/LEPR在兩個發(fā)育階段的表達(dá)差異進(jìn)行檢測,探究Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系;以3周
3、齡朝鮮龍城母鵪鶉為研究對象,對其進(jìn)行禁食和禁食后恢復(fù)采食處理,分析不同處理條件下促食欲基因、抑食基因以及Leptin/LEPR的差異表達(dá)情況,探究Leptin/LEPR與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系。主要得到以下結(jié)果:
1.運用已公布的禽類Leptin序列在日本鵪鶉的SRA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列查找,根據(jù)拼接獲得的鵪鶉Leptin序列設(shè)計PCR引物,首次克隆了鵪鶉Leptin基因外顯子4(參照野生鳥類的基因結(jié)構(gòu))的部分核苷酸序列;序列分析
4、表明其GC含量較高(64%),其預(yù)測氨基酸序列與其他脊椎動物L(fēng)eptin的氨基酸序列一致性較低,但擁有保守的結(jié)構(gòu)域。
2.運用兼并引物設(shè)計和PCR克隆技術(shù),首次克隆得到了鵪鶉LEPR的CDS序列,同時鑒定出該受體的四種不同的剪接亞型,其中qLEPRl屬于長型受體,其預(yù)測氨基酸序列包含信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的所有保守的基序、結(jié)構(gòu)域和基本的殘基,而其他三種亞型(qLEPR-a、qLEPR-b和qLEPR-c)屬于可溶型受體,缺乏跨膜域和胞內(nèi)
5、域,同時也缺乏Leptin的綁定結(jié)合域;基因進(jìn)化分析表明,鵪鶉LEPR與Leptin在脊椎動物中的進(jìn)化關(guān)系相似,其與家禽尤其是雞形目的物種同源性最高。
3.運用實時熒光定量PCR技術(shù)對已獲得的Leptin/LEPR進(jìn)行組織表達(dá)模式的研究,結(jié)果表明,鵪鶉Leptin和LEPR呈廣泛性組織表達(dá)特點,提示其具有廣泛的生物學(xué)功能。鵪鶉Leptin在骨骼肌、胰腺和下丘腦中表達(dá)相對較高,而LEPR在垂體中極高表達(dá),提示Leptin/LEP
6、R在鵪鶉的腦部能量平衡的控制、繁殖調(diào)控以及肌肉發(fā)育方面扮演重要角色。鵪鶉Leptin/LEPR在肝臟和脂肪組織中低表達(dá),表明鵪鶉Leptin不是一個脂肪依賴性分泌的激素。
4.通過對繁殖相關(guān)基因和Leptin/LEPR在鵪鶉不同發(fā)育階段差異表達(dá)的研究,初步探究了Leptin/LEPR與鵪鶉繁殖調(diào)控的關(guān)系,結(jié)果顯示,與3周齡鵪鶉相比,20周齡鵪鶉繁殖相關(guān)基因(GnRH-I、FSH-β、FSHR和LHR)在性腺軸上顯著上調(diào)表達(dá),其
7、性腺軸被激活,此時,Leptin和t-qLEPR(包含鵪鶉LEPR的所有亞型)在其下丘腦和垂體中也上調(diào)表達(dá),表明Leptin/LEPR與鵪鶉的性腺軸激活存在一定的正相關(guān)關(guān)系;伴隨著鵪鶉的性成熟并進(jìn)入產(chǎn)蛋高峰期,促卵泡發(fā)育和卵巢激素分泌的基因(如:LHR和FSHR)上調(diào)表達(dá),然而Leptin和t-qLEPR在20周齡鵪鶉的卵巢中表達(dá)下調(diào),同時凋亡基因caspase3在其卵泡中的表達(dá)也下調(diào),表明Leptin/LEPR系統(tǒng)對鵪鶉卵泡的發(fā)育有一
8、定的抑制效應(yīng)。
5.本試驗通過對3周齡鵪鶉進(jìn)行禁食和禁食后恢復(fù)采食處理,并檢測其促食欲基因(AgRP/NPY)、厭食基因(POMC和MC4R)和Leptin/LEPR的差異表達(dá)情況,初步探究了Leptin/LEPR系統(tǒng)與鵪鶉采食調(diào)控的關(guān)系,結(jié)果顯示,AgRP/NPY在禁食階段顯著上調(diào),在恢復(fù)采食時顯著下調(diào);POMC和MC4R在禁食和恢復(fù)采食階段不同程度的下調(diào);而Leptin/LEPR的表達(dá)在禁食時上調(diào),恢復(fù)采食時下調(diào);這些結(jié)果
9、表明Leptin可能不作為抑食因子參與鵪鶉的食欲調(diào)控。
綜上所述,鵪鶉Leptin及其受體LEPR被首次克隆獲得,擁有不同于其他動物同源物的獨特的組織表達(dá)模式;鵪鶉Leptin不是一個脂肪或肝臟依賴性分泌的激素,其在鵪鶉的腦部能量平衡的控制、繁殖調(diào)控以及肌肉發(fā)育方面扮演重要角色;Leptin/LEPR系統(tǒng)與鵪鶉的性腺軸激活存在一定的正相關(guān)關(guān)系,同時對鵪鶉卵泡的發(fā)育有一定的抑制效應(yīng);Leptin可能不作為抑食因子參與鵪鶉的食欲調(diào)
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