家蠶5-HT受體基因的克隆鑒定及5-HT1ABm受體功能的初步研究.pdf

1、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)，又名血清素(Serotonin)，是一種單胺類(lèi)小分子物質(zhì)，廣泛分布于脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物中。作為神經(jīng)遞質(zhì)，5-HT與動(dòng)物的發(fā)育、感覺(jué)、行為、認(rèn)知、記憶等密切相關(guān);作為調(diào)質(zhì)，5-HT可以促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育成熟、調(diào)節(jié)某些激素釋放、促進(jìn)血管收縮等。
　　5-HT發(fā)揮作用必需依靠5-HT受體來(lái)介導(dǎo)完成。在人類(lèi)，5-HT受體與偏頭痛、老年癡呆、抑郁、自殺等精神性疾病息息相關(guān)，目前醫(yī)

2、學(xué)上治療精神性疾病的藥物，80％都是以5-HT受體作為治療靶點(diǎn)。在動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)5-HT1A、5-HT1B、5-HT1D、5-HT1E、5-HT1F、5-HT2A、5-HT2B、5-HT2C、5-HT3、5-HT4、5-HT5A、5-HT5B、5-HT6、5-HT7等14種5-HT受體，其中13種為G蛋白偶聯(lián)受體，1種為配體門(mén)控離子通道受體。家蠶作為一種重要的鱗翅目模式昆蟲(chóng)，研究其5-HT受體對(duì)探索農(nóng)林上鱗翅目害蟲(chóng)防治具有重要意義，但迄今

3、未見(jiàn)有關(guān)家蠶5-HT受體的報(bào)道。本文克隆了家蠶5-HT受體，并對(duì)其表達(dá)以及功能進(jìn)行了分析，結(jié)果如下:
　　1、在家蠶中存在5-HT1ABm、5-HT1BBm、5-HT2Bm、5-HT7Bm4種5-HT受體基因。
　　以家蠶幼蟲(chóng)5齡3天頭eDNA為模板，克隆的5-HT1ABm CDS為1441bp，其中ORF長(zhǎng)1395bp。5-HT1ABm基因位于家蠶8號(hào)染色體，包含3個(gè)外顯子2個(gè)內(nèi)含子，預(yù)測(cè)編碼464個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為

4、51.752KD，等電點(diǎn)為9.13，含有7次跨膜化學(xué)受體蛋白結(jié)構(gòu)域;5-HT1ABm主要在5齡3天幼蟲(chóng)的頭部、腹部神經(jīng)、精巢、卵巢有高量表達(dá)，其它組織表達(dá)較低或者不表達(dá);5-HT1ABm在雌性成蟲(chóng)組織中的表達(dá)與雄性相似，都是在胸部、觸角、足、生殖器有一定表達(dá)，其它組織表達(dá)量低或者不表達(dá)。
　　以家蠶幼蟲(chóng)5齡3天卵巢eDNA為模板，克隆的5-HT1BBm CDS為1428bp，其中ORF長(zhǎng)為1341bp。5-HT1BBm位于家蠶10

5、號(hào)染色體，包含3個(gè)外顯子2個(gè)內(nèi)含子，預(yù)測(cè)編碼446個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為48.599KD，等電點(diǎn)為8.95，具有7次跨膜化學(xué)受體蛋白結(jié)構(gòu)域;5-HT1BBm在5齡3天幼蟲(chóng)的各個(gè)組織中均有表達(dá)，在絲腺中表達(dá)量較低;成蟲(chóng)期5-HT1BBm在雌性的胸部、腹部、觸角、翅、足、生殖器的擴(kuò)增帶比較暗，在雄性的頭、腹部、觸角和生殖器有低量表達(dá)。
　　以家蠶幼蟲(chóng)5齡3天精巢eDNA為模板，克隆的5-HT2Bm CDS為1881bp，其ORF長(zhǎng)為

6、1881bp。5-HT2Bm基因位于家蠶15號(hào)染色體，包含2個(gè)外顯子1個(gè)內(nèi)含子，預(yù)測(cè)編碼626個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為69.294KD，等電點(diǎn)為9.97，含有7次跨膜化學(xué)受體蛋白結(jié)構(gòu)域;5-HT2Bm僅在5齡3天幼蟲(chóng)的頭、腹部神經(jīng)、精巢中有較低表達(dá)，而在成蟲(chóng)雌性和雄性各組織未見(jiàn)明顯擴(kuò)增帶。
　　以家蠶幼蟲(chóng)5齡3天頭eDNA為模板，克隆的5-HT7Bm CDS為1510bp，其中ORF長(zhǎng)為1497bp。5-HT7Bm基因位于家蠶26

7、號(hào)染色體，包含2個(gè)外顯子1個(gè)內(nèi)含子，預(yù)測(cè)編碼498個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其分子量為56.132KD，等電點(diǎn)為9.03，含有7次跨膜化學(xué)受體蛋白結(jié)構(gòu)域;5-HT7Bm在5齡3天幼蟲(chóng)的頭部表達(dá)量最高，腹部神經(jīng)、中腸、脂肪體、精巢、卵巢也有表達(dá)，其它組織未見(jiàn)有明顯擴(kuò)增條帶;5-HT7Bm在雌蛾和雄蛾的胸部、腹部、觸角、翅、足、生殖器有表達(dá)，尤其在雄蛾的生殖器中表達(dá)量最高。
　　2、對(duì)5-HT受體蛋白序列的多序列比對(duì)和進(jìn)化分析:家蠶5-HT1AB

8、m、5-HT1BBm、5-HT2Bm、5-HT7Bm4種受體間的氨基酸序列相似性為30.4％。5-HT1A、5-HT1B、5-HT2、5-HT7這4種受體在昆蟲(chóng)中的相似性分別為45.4％、61.4％、48.4％、54.1％，在人類(lèi)、小鼠、原雞、斑馬魚(yú)、果蠅和家蠶等脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物間跨膜區(qū)的相似性分別為76.9％、77.7％、67.1％、56.8％，非跨膜區(qū)的相似性分別為25.1％、54.3％、31.0％、37.4％，4種受體總的相似

9、度在跨膜區(qū)可達(dá)45.2％，在非跨膜區(qū)為12.1％。推測(cè)跨膜區(qū)的高保守性可能是5-HT受體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和信息傳遞的保障，非跨膜區(qū)的保守氨基酸序列可能是配體結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)不可或缺的。進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，不同物種的相同受體首先聚為一類(lèi)，而同一受體隨著物種之間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近而形成分支，其中家蠶5-HT受體的進(jìn)化關(guān)系與煙草天蛾較為緊密。推測(cè)5-HT1、5-HT2、5-HT7等3類(lèi)受體可能在脊椎動(dòng)物與無(wú)脊椎動(dòng)物分化前已經(jīng)形成;5-HT1受體可能在昆蟲(chóng)形成

10、時(shí)發(fā)生了一次重復(fù)，2個(gè)拷貝在進(jìn)化中逐漸形成功能有異的5-HT1A受體和5-HT1B受體。
　　3、對(duì)5-HT1ABm的功能研究發(fā)現(xiàn):5-HT1ABm與家蠶的活力有很顯著的關(guān)系，無(wú)論對(duì)家蠶幼蟲(chóng)還是雄蛾注射5-HT1A受體抑制劑，能顯著降低其活力。推測(cè)5-HT1ABm受體可能參與家蠶行為活動(dòng)的控制。而5-HT1A受體激動(dòng)劑對(duì)家蠶的影響并不明顯，可能由于氨基酸序列的差異，導(dǎo)致脊椎動(dòng)物5-HT1A受體激動(dòng)劑對(duì)家蠶5-HT1A受體結(jié)合能力的