人溶血磷脂酸受體3基因的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、目的:克隆人質(zhì)子感知受體LPAR3基因、構(gòu)建LPAR3基因的表達(dá)載體并瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HO-8910細(xì)胞，檢測(cè)LPAR3的表達(dá)及研究其對(duì)細(xì)胞遷移的作用。
　　方法:設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)LPA3基因的引物，從含有人LPAR3序列的質(zhì)粒中克隆不含終止密碼子的LPAR3基因并亞克隆到pMD19-T載體。將鑒定出的陽(yáng)性質(zhì)粒和表達(dá)載體pIRES2-EGFP用XhoⅠ酶和BamHⅠ酶雙酶切回收后連接獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-LPA3，并測(cè)序鑒定

2、;重組載體以Lipofectamine LTX& Plux Reagent介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞（293T細(xì)胞）。用Real time PCR法檢測(cè)外源基因在293T細(xì)胞中的表達(dá)。隨后將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞HO-8910中，用Real time PCR法檢測(cè)LPAR3在野生型細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中LPAR3基因表達(dá)量，同時(shí)檢測(cè)在LPA刺激下的兩種細(xì)胞的增殖情況。
　　結(jié)果:測(cè)序和酶切證實(shí)了克隆到LPAR3基因并獲得了pIRES2-EGFP

3、-LPAR3表達(dá)載體;熒光顯微鏡照相與Real time PCR都證實(shí)了LPAR3基因在293T細(xì)胞當(dāng)中的高表達(dá);同時(shí)定量檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)LPAR3基因在人卵巢癌細(xì)胞（HO-8910細(xì)胞）中高表達(dá)。LPA梯度刺激HO-8910細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，LPA可以抑制細(xì)胞的增殖效應(yīng)，同時(shí)LPA刺激LPAR3轉(zhuǎn)基因細(xì)胞相比未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖能力下降。
　　結(jié)論:基因克隆構(gòu)建得到LPAR3基因和表達(dá)載體pIRES2-EGFP-LPAR3，轉(zhuǎn)染細(xì)胞檢測(cè)到LPAR