華支睪吸蟲溶血磷脂酶基因（LysoPLA）的克隆表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、研究目的華支睪吸蟲(Clonorchis sinensis)又稱肝吸蟲,成蟲寄生于肝膽管內(nèi),可引起華支睪吸蟲病(clonorchiasis),又稱肝吸蟲病.主要流行于東南亞地區(qū),全世界估計(jì)有2800萬(wàn)病人.中國(guó)有華支睪吸蟲感染者近2000萬(wàn),廣東省為主要的高發(fā)區(qū),估計(jì)感染者約500萬(wàn)人.該實(shí)驗(yàn)從華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)中克隆出一個(gè)新基因--溶血磷脂酶基因(lysophospholipase,lysoPLA),溶血磷脂酶是一種作用于生物

2、膜上作為調(diào)節(jié)控制多功能溶血磷脂酸的酶,其作用主要是水解溶血磷脂酸,在宿主患病時(shí)能提高溶血磷脂酸的表達(dá)水平<'[2]>.而溶血磷脂酸在磷脂的新陳代謝中發(fā)揮著類除垢劑的作用,其在生理學(xué)上和病理學(xué)上發(fā)揮著重要的作用[1^4].該研究希望通過(guò)克隆表達(dá)溶血磷脂酶基因,并對(duì)其功能進(jìn)行初步的研究,為研究華支睪吸蟲疫苗提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù).研究?jī)?nèi)容包括lysoPLA基因的克隆表達(dá)、蛋白免疫大白鼠后的免疫反應(yīng).方法①華支睪吸蟲lysoPLA基因的體外擴(kuò)增、

3、克隆通過(guò)華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫(kù)篩選識(shí)別華支睪吸蟲新基因,以cDNA文庫(kù)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出lysoPLA基因的編碼區(qū)序列,1.0％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定.PCR產(chǎn)物、質(zhì)粒pGEX-4T-1分別酶切、回收,后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、初篩、PCR與酶切鑒定.②華支睪吸蟲lysoPLA基因的原核表達(dá)和純化利用IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)出lysoPLA基因,經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物,表達(dá)產(chǎn)物大小與預(yù)測(cè)結(jié)果相符,證實(shí)lysoPLA基因可以在原

4、核生物E. coli Bl-21中進(jìn)行表達(dá).③lysoPLA純化蛋白免疫大白鼠所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答利用純化的蛋白,結(jié)合福氏佐劑對(duì)SD大白鼠進(jìn)行蛋白免疫,在大鼠的腹部和大腿內(nèi)側(cè)的皮內(nèi)進(jìn)行多點(diǎn)注射免疫.結(jié)論成功構(gòu)建了含lysoPLA基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒,并誘導(dǎo)表達(dá)出華支睪吸蟲的lysoPLA融合蛋白,在動(dòng)物免疫中得到陽(yáng)性結(jié)果,證明融合蛋白有抗原-抗體免疫反應(yīng)性.有關(guān)溶血磷脂酶在華支睪吸蟲中的作用以及其在預(yù)防、治療華支睪吸蟲病的意義有待進(jìn)一步的