葡萄果實中磷脂酶D基因的克隆及其在溫度鍛煉中的作用.pdf

1、本研究以霞多麗葡萄(Vitis Vinifera L.cv.Chardonnay)果實為試材，首先克隆了其磷脂酶Da基因的cDNA序列全長，然后在活性、蛋白、mRNA水平研究了葡萄磷脂酶D在溫度鍛煉中的變化規(guī)律，并進一步通過抑制劑處理分析了磷脂酶D介導的溫度鍛煉信號傳遞機制。主要結(jié)果如下： 根據(jù)GenBank中登陸的其他植物磷脂酶Da序列，設(shè)計合成簡并引物，利用RT-PCR(reversetranscriptation-poly

2、merase chain reaction)和RACE(rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆了葡萄果實磷脂酶Da的cDNA全長序列，并在GenBank進行了注冊登錄，登錄號為DQ333882。此核苷酸序列具有完整的開放閱讀框，編碼區(qū)全長2430bp。軟件分析顯示，葡萄磷脂酶Da基因編碼一個由809個氨基酸組成的多肽，分子量91.8KDa，其氨基酸序列與擬南芥(Arabidopsis)、蓖麻(Rici

3、nus communis)中的磷脂酶Da分別有74％和84％的同源性。生物信息學研究顯示，該葡萄磷脂酶Da具有C2結(jié)構(gòu)域、HKD結(jié)構(gòu)域等植物磷脂酶D的典型結(jié)構(gòu)特征。以[a-<'32>P]標記的葡萄磷脂酶Da基因的3'末端作為探針與基因組DNA進行雜交發(fā)現(xiàn)，該基因在葡萄基因組可能存在1-2個拷貝。 采用底物放射性標記法，對葡萄果實磷脂酶D活性測定時發(fā)現(xiàn)，當pH值為6.5的Mes緩沖液系統(tǒng)中含有15mM Ca<'2+>時，磷脂酶D具

4、有最大活性。通過進一步優(yōu)化反應體系中蛋白含量和反應時間，建立了葡萄果實磷脂酶D活性測定的技術(shù)體系。為探討磷脂酶D在果實采后適應性中的作用奠定了基礎(chǔ)。 溫度鍛煉是提高植物耐熱性的有效方法，但目前對于植物如何感知、識別溫度信號進而放大、傳遞到胞內(nèi)的作用機理仍不完全清楚。在38℃高溫鍛煉的初期，葡萄果實中磷脂酶D的活性明顯增強，擬南芥PLDa1抗體免疫識別的蛋白分子量為92KDa，與根據(jù)葡萄磷脂酶D氨基酸序列計算的分子量相似，其在高溫

5、鍛煉中的變化規(guī)律與磷脂酶D活性的變化一致。而RT_PCR分析的結(jié)果則表明，早在高溫鍛煉的第30min葡萄磷脂酶D mRNA就出現(xiàn)表達高峰。使用磷脂酶D的活性抑制劑正丁醇對葡萄果實進行預處理后，則發(fā)現(xiàn)高溫鍛煉誘導的果實組織內(nèi)自由態(tài)SA含量的升高、HSP73蛋白的表達均被抑制。以上結(jié)果說明，磷脂酶D活性的升高可以作為果實響應高溫信號的前期反應，并且磷脂酶D可能作為上游信號組分參與SA信號系統(tǒng)影響高溫鍛煉誘導果實耐熱性的產(chǎn)生。 8℃低