水稻磷脂酶C調(diào)節(jié)耐鹽性以及磷脂酶D參與種子老化的研究.pdf

1、至今為止，在植物和細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)三類(lèi)磷脂酶，按其水解磷脂部位的不同分別命名為磷脂酶A、磷脂酶C和磷脂酶D。這些磷脂酶參與了植物生長(zhǎng)、發(fā)育和逆境脅迫等多個(gè)生理過(guò)程。但是，這三種磷脂酶都是由多基因組成的，從分子水平上闡明各基因與基因?qū)?yīng)的生理功能關(guān)系的報(bào)道尚不多見(jiàn)。在本研究中，我們鑒定出水稻PLC3（OsPLC3）與耐鹽性有關(guān)，該基因?qū)儆赑I-PLC。我們還研究了種子老化中磷脂水平的變化及膜與PLD的關(guān)系，具體結(jié)果如下。
　　 磷脂酶C

2、根據(jù)其作用底物的不同又可以分為底物非特異性磷脂酶C(NPC)和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)。PI-PLC水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PI(4，5)P2)，同時(shí)生成兩個(gè)重要的第二信使分子二酰甘油(DAG)和肌醇三磷酸(IP3)。通過(guò)對(duì)水稻基因組的搜索發(fā)現(xiàn)，水稻基因組中共有4個(gè)PLC，分別位于第3、5、7和12對(duì)染色體上。我們分析了水稻PLC在各個(gè)組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsPLC1在各組織中表達(dá)均較低;OsPLC2在根中和幼葉中的

3、表達(dá)量較高;OsPLC3在老葉片中的表達(dá)量相對(duì)較高;OsPLC4在根中表達(dá)較高。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)OsPLCs對(duì)低溫、ABA、干旱和鹽脅迫均有不同程度的應(yīng)答。鹽脅迫下，OsPLC1表達(dá)基本不變;OsPLC2表達(dá)先上升，然后下降;OsPLC3和OsPLC4隨鹽處理時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)不斷增加。其中，OsPLC3表達(dá)增加最顯著。我們獲得了OsPLC2和OsPLC3的突變體，對(duì)其功能作了深入研究。通過(guò)原核表達(dá)的方式在大腸桿菌BL21中分別表達(dá)了OsPLC2

4、和OsPLC3。通過(guò)對(duì)PI(4)P、PI(4，5)P2和PC的水解能力分析，發(fā)現(xiàn)OsPLC2和OsPLC3都可以水解PI(4)P和PI(4，5)P2，但不水解PC，這說(shuō)明了OsPLC2和OsPLC3屬于PI-PLC。通過(guò)水稻原生質(zhì)體的瞬時(shí)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)OsPLC2-YFP和OsPLC3-YFP定位于原生質(zhì)體的質(zhì)膜上。利用基因槍將OsPLC2-YFP和OsPLC3-YFP轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，通過(guò)質(zhì)壁分離后進(jìn)一步證實(shí)了OsPLC2和Os

5、PLC3定位在質(zhì)膜上。
　　 我們鑒定并獲得了Tos17插入OsPLC2和OsPLC3的突變體。在正常生長(zhǎng)條件下，osplc3的多個(gè)農(nóng)藝性狀與野生型具有顯著差異，株高、結(jié)實(shí)率下降。osplc3植株中DAG和PA的含量也明顯的低于野生型。通過(guò)對(duì)干旱和鹽脅迫下的表型分析發(fā)現(xiàn)，osplc3對(duì)鹽處理十分敏感，osplc2對(duì)兩種脅迫的表型與野生型(WT)沒(méi)有明顯差異。鹽脅迫處理后，osplc3植株中地上部與地下部的Na+含量明顯高于WT和

6、osplc2，并且其N(xiāo)a+/K+比值也顯著高于野生型。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明OsPLC3在水稻耐鹽脅迫應(yīng)答中起正調(diào)節(jié)作用?；谶@種些結(jié)果，我們進(jìn)一步分析了一系列與鹽脅迫相關(guān)的基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，在鹽脅迫處理下，OsPLC3的缺失可以明顯抑制多個(gè)受鹽誘導(dǎo)的基因的表達(dá)，包括OsbZIP23、OsP5CS、OsHKT;1、OsMSR2、OsLEA3和OsCDPK7。其中已知，OsMSR2、OsLEA3和OsCDPK7是受鈣信號(hào)調(diào)控的，而PLC水解

7、產(chǎn)物之一IP3可以觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+。由此推測(cè)，OsPLC3可能至少是部分通過(guò)IP3-Ca2+途徑來(lái)調(diào)控水稻耐鹽反應(yīng)的。
　　 對(duì)水稻種子人工老化過(guò)程中脂類(lèi)含量變化的研究發(fā)現(xiàn)，隨著種子人工老化，磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰甘油(PG)等磷脂的含量顯著降低。而作為磷脂酶D的水解產(chǎn)物，磷脂酸的含量顯著升高。有趣的是，升高磷脂酸的分子種與降低的PC、PE的分子種都是一致的，從此可以推測(cè)升高的磷脂酸可能是從磷

8、脂酶D水解PC或（和）PE而來(lái)。通過(guò)基因表達(dá)量分析，我們發(fā)現(xiàn)水稻種子中OsPLDα1和α3是主要的PLDα，而且種子人工老化可以增加OsPLDα1和OsPLDα3的表達(dá)。種子人工老化還可以誘導(dǎo)PLDα蛋白的表達(dá)，提高其活性。我們又分析了種子人工老化過(guò)程中三個(gè)LOX基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)種子人工老化可以誘導(dǎo)OsLOX2表達(dá)。
　　 總之，通過(guò)遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生理學(xué)等手段，我們鑒定了OsPLC3是PI-PLC，并正向調(diào)節(jié)水稻耐鹽性