磷脂酶D的共價(jià)及聚集交聯(lián)固定化技術(shù)研究.pdf

1、磷脂酶D(PhospholipaseD簡稱PLD)即磷脂酰膽堿酶[EC3.1.4.4]，其催化的磷脂堿基交換反應(yīng)在磷脂結(jié)構(gòu)改造上具有重要應(yīng)用價(jià)值。但是發(fā)酵產(chǎn)PLD活力低、純化困難且須在有機(jī)溶媒的條件下應(yīng)用，所以為固定化技術(shù)提出了較高要求。共價(jià)固定化法是酶與載體通過共價(jià)鍵結(jié)合的一種方法，具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性，固定化PLD前景良好。本文對(duì)磷脂酶D的固定化方法進(jìn)行了研究。 以纖維素為載體，用環(huán)氧氯丙烷活化，再讓其與酶氨基酸殘基

2、反應(yīng)，共價(jià)固定PLD?？疾炝藟A種類及濃度、纖維素與環(huán)氧氯丙烷比例、活化時(shí)間對(duì)酶固定化率的影響：優(yōu)化了固定化反應(yīng)時(shí)間、溫度、載體與酶比例；并比較了固定化酶與游離酶的穩(wěn)定性。獲得的最優(yōu)載體活化條件為：1mol/LNaOH20ml，纖維素1g，ECH4ml，時(shí)間12h；最優(yōu)固定化條件為：環(huán)氧基纖維素1g，酶20ml(粗酶蛋白質(zhì)濃度0.8g/L)37℃、固定化反應(yīng)時(shí)間12h。獲得的最大固定化率為48.8％。固定化磷脂酶D的最適反應(yīng)pH為8.0、

3、最適反應(yīng)溫度為40℃，與游離酶相比沒變，但熱穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性均高于游離磷脂酶D。 由于磷脂酶D比較難于獲得，我們以糖化酶為研究對(duì)象，研究聚集交聯(lián)固定化方法。分別以纖維素、粗孔硅膠和用環(huán)氧氯丙烷活化的纖維素為載體，加入硫酸銨作為沉淀劑使酶富集到載體上，結(jié)果表明，無論什么形式的載體，同樣條件下，加沉淀劑可使單位載體的酶蛋白負(fù)載率提高。確立了酶聚集交聯(lián)固定化方法，并對(duì)這種固定化方法進(jìn)行了研究。 用聚集交聯(lián)法固定磷脂酶D，并對(duì)

4、固定條件進(jìn)行優(yōu)化，研究了這種方法固定的磷脂酶D的性質(zhì)。最優(yōu)固定化條件為：以纖維素為載體，酶液與載體及沉淀劑的量之比為5ml·0.8mg/ml：1g：10ml硫酸銨。加入酶液和載體吸附一定時(shí)間，然后加入沉淀劑，同時(shí)加入戊二醛，使溶液的戊二醛濃度達(dá)到0.12％，磁力攪拌40min，再加戊二醛，使溶液的戊二醛濃度達(dá)0.18％，搖床反應(yīng)30min，過濾、洗滌、真空干燥得固定化酶。聚集交聯(lián)法固定化磷脂酶D的最適pH為8.0、最適水解溫度為50℃，