磷脂酶A1催化大豆磷脂水解及其酯交換研究.pdf

1、首先研究了利用核磁共振氫譜（Proton Nuclear Magnetic Resonance,1H-NMR）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detector，HPLC-ELSD）對磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine）、溶血磷脂酰膽堿(Lyso-phospholipid)、甘油磷脂酰膽

2、堿(L-α-Glycerophosphorylcholine)進(jìn)行定量分析檢測，建立起有效的定性及定量手段。然后以磷脂酰膽堿純度35％的富集磷脂為原料，磷脂酶A1(Phospholipase A1)為工具酶，分別在水相體系中制備LPC，在油水乳化體系中制備GPC，在油水乳化體系中制備富含亞麻酸的結(jié)構(gòu)磷脂。具體研究如下：
　　（1）利用核磁共振氫譜測定磷脂酶 A1水解大豆磷脂酰膽堿后的樣品中磷脂酰膽堿（PC）、溶血磷脂酰膽堿（LPC

3、）、甘油磷脂酰膽堿（GPC）的相對含量。具體操作為用氘代甲醇溶解樣品，進(jìn)行核磁共振氫譜測定。對比標(biāo)準(zhǔn)品的核磁共振氫圖譜，分別選取化學(xué)位移δ=4.14~4.16、3.76~3.83、4.40~4.50三處的信號峰作為PC、 LPC和GPC的特征性質(zhì)子峰，并根據(jù)PC、 LPC和GPC質(zhì)子峰相對面積與他們的相對分子質(zhì)量計算三者的相對含量。結(jié)果表明，PC、LPC、GPC的平均標(biāo)樣添加回收率分別為103.4%、85.6%、104.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏

4、差（RSD，n=3）分別為2.2%、5.0%、6.2%。儀器精密度測試中，同一個樣品中PC、LPC、GPC含量的RSD（n=5）分別為4.2%，3.5%，2.3%。最后利用本方法對磷脂酶A1水解磷脂的兩個樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明本方法適用于檢測樣品中PC、LPC、GPC的相對含量。
　　（2）研究利用HPLC-ELSD測定磷脂樣品中甘油磷脂酰膽堿（GPC）含量。檢測條件為：島津CBM20A液相系統(tǒng)，AlltechSilica色譜柱（

5、4.6 mm×250 mm，5μm），柱溫40℃，甲醇為流動相，流速1.0 mL/min，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度65℃，空氣流速1.7 L/min。結(jié)果顯示GPC為最后出峰的強(qiáng)極性組分，其保留時間為4.97分鐘，所得GPC標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=2.0483X+7.7744，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.9914。檢測限為6.3μg/mL(S/N=3)，定量限為13.0μg/mL(S/N=10)。GPC的平均加標(biāo)回收率為102.5%，RSD是2.2%

6、（n=3）。表明本方法分離效果好，檢測結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定,適用于酶催化水解磷脂樣品中甘油磷脂酰膽堿的定量測定。
　　（3）研究在油包水乳化體系中利用磷脂酶 A1水解磷脂制備 LPC。首先利用甲醇作為萃取溶劑制備磷脂酰膽堿（PC）含量為37%左右的富集磷脂，然后在水相體系中利用磷脂酶A1水解富集磷脂，制備溶血磷脂酰膽堿（LPC）。分別討論了料液比、酶添加量、反應(yīng)時間對 LPC得率的影響。結(jié)果表明最佳料液比（富集磷脂：水）、酶添加量、反應(yīng)

7、時間分別為：1：4、66.7 U/mL、2 h，最佳條件下樣品酸值為62.2 mg/g。
　?。?）研究了主要在油包水乳化體系中利用磷脂酶A1水解磷脂制備GPC。因為磷脂酶A1是界面酶，所以利用油包水乳化體系顯著增大反應(yīng)體系的界面面積可以提高酶的作用效率，使得高效制備GPC成為可能。研究結(jié)果顯示最佳水解條件為：油脂添加量為磷脂質(zhì)量的4倍，水分添加量為磷脂質(zhì)量的15%，酶添加量為磷脂質(zhì)量的10%，反應(yīng)時間2.5 h。最后水解樣品中G

8、PC的純度為27%。
　　（5）利用亞麻籽油和自制富集磷脂為原料，利用磷脂酶 A1在無溶劑體系中首先在常壓含水環(huán)境中催化水解磷脂和亞麻籽油生成亞麻酸和甘油磷脂酰膽堿等，然后在真空無水條件下，磷脂酶A1催化亞麻酸與甘油磷脂酰膽堿合成富含亞麻酸的結(jié)構(gòu)磷脂。分別研究體系水分含量、常壓水解時間、酶添加量和原料比例對結(jié)果的影響，利用三氟化硼法對制得結(jié)構(gòu)磷脂進(jìn)行甲酯化，然后利用GC-FID檢測亞麻酸含量。結(jié)果表明最佳的水分含量、常壓水解時間、