水稻磷脂酶C(OsPLC1)胞內(nèi)定位和水解底物的研究.pdf

1、磷脂信號(hào)在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境應(yīng)對(duì)方面都具有重要作用，因此磷脂信號(hào)通路一直是研究的熱點(diǎn)。磷脂酶能夠水解細(xì)胞膜上的磷脂，并產(chǎn)生一系列的信號(hào)分子，因此在磷脂信號(hào)通路中起著重要作用。磷脂酶按其水解磷脂的部位不同，可以分為磷脂酶A(phospholipase A，PLA)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)、磷脂酶D(phospholipaseD，PLD)。其中植物磷脂酶C按其作用底物的不同可分為底物非特異性磷脂酶C(nonspe

2、cific phospholipase C，NPC)和磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC）。生物信息學(xué)的資料顯示，水稻中存在4個(gè)PI-PLC，但作用機(jī)理尚不明確。本論文以水稻OsPLC1基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以實(shí)驗(yàn)室已鑒定出的水稻野生型（日本晴）和Tos17單拷貝插入的OsPLC1缺失突變體為材料，初步探究了水稻PI-PLC家族中OsPLC1的胞內(nèi)定位情況

3、及其對(duì)水解底物的情況。具體研究如下:
　　我們構(gòu)建了OsPLC1自身啟動(dòng)子啟動(dòng)的GFP-OsPLC1表達(dá)載體，在煙草中表達(dá)ProPLC1∷GFP-OsPLC1融合蛋白，發(fā)現(xiàn)OsPLC1自身啟動(dòng)子啟動(dòng)的GFP-OsPLC1定位在質(zhì)膜和靠近質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)中，這與實(shí)驗(yàn)室之前研究的pSuper∷GFP-OsPLC1在煙草中的定位情況一致。隨后為了進(jìn)一步確定OsPLC1的定位情況，我們將兩種啟動(dòng)子啟動(dòng)的GFP-OsPLC1永久表達(dá)載體通告轉(zhuǎn)基

4、因技術(shù)轉(zhuǎn)入野生型中，結(jié)果只獲得了穩(wěn)定遺傳的pSuper∷GFP-OsPLC1的轉(zhuǎn)基因植株。隨后用激光共聚焦觀察轉(zhuǎn)基因植株中OsPLC1的定位，得出了和煙草中同樣的結(jié)論，即OsPLC1定位在質(zhì)膜和靠近質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)中。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OsPLC1的定位，我們用兩相法分離轉(zhuǎn)基因植株的細(xì)胞質(zhì)膜和胞質(zhì)，隨后用GFP抗體進(jìn)行蛋白免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果表明質(zhì)膜和胞質(zhì)中均存在GFP-OsPLC1。且當(dāng)鹽處理15min后，質(zhì)膜GFP-OsPLC1明顯增多，而胞

5、質(zhì)GFP-OsPLC1有所減少。因此我們推測(cè)正常生長(zhǎng)情況下，OsPLC1主要存在于胞質(zhì)中，而當(dāng)植株受到鹽脅迫后，胞質(zhì)中的OsPLC1會(huì)迅速錨定在質(zhì)膜，水解底物，從而參與鹽脅迫響應(yīng)。蛋白免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果還顯示，質(zhì)膜GFP-OsPLC1分子量略大于胞質(zhì)質(zhì)膜GFP-OsPLC1，這可能與質(zhì)膜上的OsPLC1被修飾有關(guān)。另外，我們?cè)噲D通過(guò)酵母雙雜技術(shù)篩選出與OsPLC1互作的蛋白，篩選得到了定位在胞質(zhì)中的JOKA2，它是否與胞質(zhì)中的OsPLC1

6、行使功能有關(guān)，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　在動(dòng)物和植物經(jīng)典研究中，PLC主要水解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(phosphatidyl-inositol4，5-bisphosphate，PtdIns(4，5)P2)。但是經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物細(xì)胞中磷脂酰肌醇4-磷酸(phosphatidylinositol4-phosphate，PtdIns4P)含量遠(yuǎn)高于PtdIns(4，5)P2，并被推測(cè)它也有作為PLC底物的可能，但缺乏證據(jù)。本論文對(duì)O

7、sPLC1的兩個(gè)可能的水解底物PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2在體內(nèi)的水解情況進(jìn)行了初步研究。我們分別克隆了PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2的特異性結(jié)合片段PHFAPP1和PHPLCδ1，構(gòu)建了Super啟動(dòng)的PHFAPP1-GFP和PHPLCδ1-GFP的永久表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將這兩個(gè)永久表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入水稻野生型(WT)和突變體(osplcl)中。首先觀察兩者在水稻中的定位，結(jié)果顯示PHFAPP1和PH

8、PLCδ1均主要定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，提示PtdIns4P和PtdIns(4，5)P2主要分布在膜上，且PtdIns4P在水稻根部呈現(xiàn)極性分布。但是PHPLCδ1在胞質(zhì)中也存在，這可能是因?yàn)榧?xì)胞中的PtdIns(4，5)P2含量很低(van Leeuwen et al.，2007)，而過(guò)量的PHPLCδ1-GFP無(wú)法與PtdIns(4，5)P2結(jié)合，從而游離在細(xì)胞質(zhì)中。隨后以PHFAPP1-GFP在野生型和突變體中的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株為材料，利

9、用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)75 mM NaCl處理下，水稻主根中PtdIns4P含量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)條件下，野生型PtdIns4P含量低于突變體，在鹽處理后，野生型PtdIns4P含量存明顯下降，突變體中PtdIns4P含量呈現(xiàn)略有上升的趨勢(shì)。隨后我們又利用薄層層析和氣相色譜技術(shù)對(duì)150 mM NaCl處理前后野生型和突變體PtdIns4P含量進(jìn)行測(cè)定。PtdIns4P含量變化趨勢(shì)與之前使用探針相一致。因此，我們推測(cè)野生型中P

10、tdIns4P含量在鹽處理后的降低是由于OsPLC1的水解作用所致。由于PtdIns(4，5)P2在植物中含量很低，這種方法靈敏度有限，我們尚無(wú)法檢測(cè)到PtdIns(4，5)P2的含量。
　　綜上所述，本文采用了分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)等試驗(yàn)方法初步確定了OsPLC1的胞內(nèi)定位，以及PtdIns(4，5)P2和PtdIns4P的亞細(xì)胞定位;通過(guò)對(duì)鹽處理前后野生型和突變體中PtdIns4P含量的檢測(cè)，初步證明OsPLC1在鹽