磷脂酶C高產(chǎn)菌株的篩選、鑒定和培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究.pdf

1、本論文通過從全國(guó)各地進(jìn)行廣泛采樣，分離和篩選出磷脂酶C(phospholipaseC，簡(jiǎn)稱PLC)產(chǎn)量高、抗血小板功能強(qiáng)的微生物菌種，在此基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行種類鑒定，同時(shí)，還對(duì)產(chǎn)酶條件以及所產(chǎn)磷脂酶C的理化特性進(jìn)行了研究，從而為今后將磷脂酶C研制開發(fā)成抗血小板聚集一類新藥打下堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 一、本研究采用的主要方法如下： 1．菌種分離采用卵黃瓊脂LB平板分離法； 2．菌種篩選采用卵黃硼砂平板酶活定性檢測(cè)、菌體生物量

2、和用對(duì)硝基磷酸膽堿(p-nitrophehylphosphoryl-choline，簡(jiǎn)稱NPPC)作為磷脂酶C的作用底物進(jìn)行酶活定量檢測(cè)以及抗血小板聚集率等多指標(biāo)多輪次篩選。 3．菌種的分類鑒定采用菌株的個(gè)體形態(tài)學(xué)特征和群體形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及16s rRNA序列等依據(jù)進(jìn)行。 4．培養(yǎng)條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)方法。主要考慮培養(yǎng)基、接種量、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間及搖床轉(zhuǎn)速等對(duì)磷脂酶C產(chǎn)酶活水平的影響。 5．磷脂

3、酶C分子量測(cè)定采用不連續(xù)SDS-PAGE法。 6．磷脂酶c酶活力測(cè)定采用卵黃硼砂平板法和NPPC法。 7．磷脂酶C溶血活性測(cè)定采用血平板法。 二、主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1．從1268份土樣中篩選獲得了4株新的高產(chǎn)磷脂酶C優(yōu)良菌株，分別將其分類鑒定為：Bacillus cereus Shenzhen 754-1、B．mycoides Shenzhen 779、B．mycoidesShenzhen 970和B.

4、 mycoides Shenzhen 1107。 2．B．cereus Shenzhen 754-1搖瓶培養(yǎng)產(chǎn)磷脂酶c的最佳產(chǎn)酶條件為：培養(yǎng)基(1％蛋白胨，0.3％牛肉膏)，培養(yǎng)溫度28℃，培養(yǎng)時(shí)間12h，接種量0．5％，轉(zhuǎn)速200r/min。在此培養(yǎng)條件下，B．cereus Shenzhen 754-1磷脂酶C的產(chǎn)酶水平達(dá)到26U/ml。 3．純化的磷脂酶C樣品分子量為75100 Da，對(duì)熱較敏感，70℃水浴處理5mi