菊花磷脂酶基因CmPLDα的克隆與功能驗證.pdf

1、磷脂酶D(PhospholipaseD，PLD，EC3.1.4.4)是催化磷脂分子中磷酸二酯鍵水解和堿基交換的一類酶。據(jù)研究報道，PLD不僅作為功能蛋白參與磷脂水解基團的轉(zhuǎn)移，其水解產(chǎn)物如磷脂酸（phosphatidic acid, PA）、二酯酰甘油（diacylglycerol，DAG）、游離脂肪酸（free fatty acid, FFA）等與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，進而參與脅迫應(yīng)答或發(fā)育調(diào)控。菊花（Chrysanthemum morifo

2、lium Ramat.）是我國十大傳統(tǒng)名花及世界四大切花之一，干旱脅迫嚴重危害菊花的產(chǎn)量與品質(zhì)。近年，隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展，菊花中也發(fā)掘了多種抗逆基因及轉(zhuǎn)錄因子，但多集中在轉(zhuǎn)錄因子參與抗逆的調(diào)控路徑信號的研究。然而，在磷脂酶參與菊花抗逆方面的研究尚未見報道。為此，本研究克隆了CmPLDa基因，分析了其表達特性，通過轉(zhuǎn)基因手段創(chuàng)制了耐旱菊花新種質(zhì)，為磷脂酶介導(dǎo)菊花脅迫應(yīng)答分子機理研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)論如下:
　　1.

3、菊花CmPLDα基因的克隆與序列分析
　　通過簡并引物、RT-PCR和RACE方法克隆出切花菊‘神馬’的磷脂酶Dα基因的全長序列，命名為CmPLDα。序列分析表明:CmPLDα全長2697bp，其中開放閱讀框(ORF)長為2427bp，編碼809個氨基酸。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，CmPLDα氨基酸序列存在典型的PLD家族HKD結(jié)構(gòu)域、C2結(jié)構(gòu)域，并且CmPLDα氨基酸序列與已知的磷脂酶D氨基酸序列同源性高達83％-88％。通過構(gòu)建系統(tǒng)

4、進化樹發(fā)現(xiàn)，CmPLDα與向日葵HaPLDα的親緣關(guān)系最近，其從屬于PLDα家族。
　　2.菊花CmPLDα基因的表達特性分析
　　利用熒光定量的方法分析了CmPLDα的組織表達特性及其在非生物脅迫、脫落酸(ABA)、蚜蟲、黑斑病接種處理下的表達特性。結(jié)果表明:CmPLDα在根、莖、葉、花等組織均有表達，在莖、葉、花中表達量較高，在根中表達較低;CmPLDα的表達幾乎不受低溫影響，整體上受機械損傷抑制，受高溫明顯抑制，受缺磷

5、和蚜蟲接種顯著誘導(dǎo)，干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)了脅迫后期CmPLDα的增加，CmPLDα受ABA處理快速誘導(dǎo);黑斑病菌接種也可誘導(dǎo)CmPLDα的表達。由此可知，CmPLDα可能參與了菊花多種脅迫過程，包括溫度、干旱、缺磷、ABA信號、蚜蟲及黑斑病等。
　　3.菊花CmPLDα基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究
　　構(gòu)建CmPLDα基因的正義表達載體和反義表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行菊花 CmPLDα基因遺傳轉(zhuǎn)化。經(jīng)PCR和qRT-PCR檢測，篩選出

6、正反義轉(zhuǎn)基因株系Z1、Z2和F1、F2。對轉(zhuǎn)基因株系進行20％ PEG6000模擬干旱脅迫處理以鑒定其抗旱性。結(jié)果表明，正義株系植株在干旱脅迫后其存活率為野生型的1.7至1.8倍，耐旱性增強。正義株系相對含水量高于對照近10％，電導(dǎo)率及MDA含量則顯著低于野生型，說明正義株系細胞膜完整度及穩(wěn)定性高于野生型。轉(zhuǎn)基因反義株系F1、F2大部分植株萎蔫皺縮，萎蔫指數(shù)分別為5和6，恢復(fù)生長后存活率低于野生型。反義株系則比正義株系的含水量要低，電導(dǎo)